Întrebarea din ce este formată insulina este de interes nu numai pentru medici și farmaciști, ci și pentru pacienții cu diabet zaharat, precum și pentru rudele și prietenii acestora. Astăzi, acest hormon unic și atât de important pentru sănătatea umană poate fi obținut din diferite materii prime folosind tehnologii special dezvoltate și testate cu atenție. În funcție de metoda de producție, se disting următoarele tipuri de insulină:

• Porcine sau bovine, numite și droguri animale
• Porci biosintetici aka porci modificați
• Inginerie genetică sau recombinantă
• Modificat prin inginerie genetică
• Sintetic

Insulina porcină este cea mai folosită pentru tratamentul diabetului. Utilizarea sa a fost începută în anii 20 ai secolului trecut. Trebuie remarcat faptul că porcinele sau animalele au fost singurul medicament până în anii 80 ai secolului trecut. Pentru a-l obține, se utilizează țesuturile pancreasului animalelor. Cu toate acestea, această metodă cu greu poate fi numită optimă sau simplă: lucrul cu materii prime biologice nu este întotdeauna convenabil, iar materiile prime în sine nu sunt suficiente.

În plus, compoziția insulinei porcine nu coincide cu compoziția hormonului produs de corpul unei persoane sănătoase: acestea conțin diverse reziduuri de aminoacizi. Trebuie remarcat faptul că hormonii produși de pancreasul bovinelor au un număr și mai mare de diferențe, care nu pot fi numite fenomen pozitiv.

În plus față de o substanță pură multicomponentă, un astfel de preparat conține invariabil așa-numita proinsulină, o substanță care este practic imposibil de separat prin metode moderne de purificare. El este cel care devine adesea sursa reacțiilor alergice, ceea ce este deosebit de periculos pentru copii și vârstnici.

Din acest motiv, oamenii de știință din întreaga lume sunt de mult interesați să aducă compoziția hormonului produs de animale în deplină conformitate cu hormonii pancreasului unei persoane sănătoase. O adevărată descoperire în farmacologia și tratamentul diabetului zaharat a fost producerea unui medicament semisintetic obținut prin înlocuirea aminoacidului alanină într-un medicament animal cu treonină.

În acest caz, metoda semi-sintetică pentru producerea hormonului se bazează pe utilizarea preparatelor de origine animală. Cu alte cuvinte, pur și simplu suferă modificări și devin identici cu hormonii produși de oameni. Printre avantajele lor se numără compatibilitatea cu corpul uman și absența reacțiilor alergice.

Dezavantajele acestei metode includ lipsa materiilor prime și complexitatea lucrării cu materiale biologice, precum și costul ridicat atât al tehnologiei în sine, cât și al medicamentului rezultat.

În acest sens, cel mai bun medicament pentru tratamentul diabetului zaharat este insulina recombinantă obținută prin inginerie genetică. De altfel, este adesea numită insulină modificată genetic, indicând astfel metoda de producție a acesteia, iar produsul rezultat se numește insulină umană, subliniind astfel identitatea sa absolută cu hormonii produși de pancreasul unei persoane sănătoase.

Printre avantajele insulinei modificate genetic, trebuie remarcat, de asemenea, gradul său ridicat de puritate și absența proinsulinei în compoziție, precum și faptul că nu provoacă reacții alergice și nu are contraindicații.

Întrebarea frecventă este destul de înțeleasă: din ce este făcută exact insulina recombinantă? Se pare că acest hormon este produs de tulpini de drojdie, precum și de E. coli, plasate într-un mediu nutritiv special. În același timp, cantitatea de substanță obținută este atât de mare încât este posibilă abandonarea completă a consumului de droguri obținute din organele animale.

Desigur, nu vorbim despre un simplu E. coli, ci despre modificate genetic și capabile să producă insulină umană solubilă modificată genetic, a cărei compoziție și proprietăți sunt exact aceleași cu cele ale hormonului produs de celulele pancreasului unei persoane sănătoase.

Avantajele insulinei modificate genetic nu sunt doar asemănarea sa absolută cu hormonul uman, ci și ușurința de producție, o cantitate suficientă de materii prime și un cost accesibil.

Oamenii de știință din întreaga lume numesc producția de insulină recombinantă o adevărată descoperire în terapia diabetului. Semnificația acestei descoperiri este atât de mare și importantă încât este dificil să o supraestimăm. Este suficient să rețineți că astăzi aproape 95% din nevoile acestui hormon sunt satisfăcute cu ajutorul insulinei modificate genetic. În același timp, mii de persoane care anterior erau alergice la medicamente au avut șansa unei vieți normale.

Recenzii și comentarii

Am diabet de tip 2 - nedependent de insulină. Un prieten m-a sfătuit să scad nivelul glicemiei cu

Prima injecție cu insulină a fost făcută în 1922. De atunci, au apărut multe tipuri de insulină, care diferă în anumite moduri. Principalele puncte de diferență dintre insuline sunt originea lor, precum și principiul și durata acțiunii.

Diferențe în originea insulinei

Conform acestui principiu, se disting următoarele tipuri de insulină:

• insulină bovină - obținută din pancreasul animalelor. Această insulină este cel mai diferită de insulina umană. De multe ori apar reacții alergice.
• carne de porc - obținută din pancreasul porcilor. Se deosebește de om într-un singur aminoacid. Insulina de porc este, de asemenea, o cauză frecventă a alergiilor.
• uman - sau mai bine zis, analogi ai insulinei umane și insulinei modificate genetic. Aceste insuline sunt obținute în două moduri: în prima metodă, insulina umană este sintetizată de E. coli, iar în a doua metodă, insulina umană este obținută din insulina porcină prin înlocuirea unui aminoacid.

Insulinele bovine includ: Insulrap GLP, Ultralente, Ultralente MS.

Insulinele de porc includ: Monodar K (15.30,50), Monodar ultralong, Monodar Long, Monosuinsulin, Insulrap SPP etc.

Insulinele umane includ: Actrapid, Novorapid, Lantus, Humulin, Humalog, Novomix, Protafan și multe altele.

Cei mai buni sunt analogii insulinei umane și insulinei modificate genetic, au o purificare mai bună; nu au efecte secundare precum insulinele animale; nu provoacă reacții alergice la fel de des ca insulinele de origine animală, deoarece nu conțin proteine \u200b\u200bstrăine, spre deosebire de insulinele animale.

Diferențe în durata de acțiune a insulinei

Conform principiului și duratei acțiunii, există insuline ultracurte, de scurtă durată, medie, acțiune prelungită.

• Insuline ultra-scurte

Insulinele ultra-scurte încep să acționeze imediat după administrare, atingând vârful după 1-1,5 și durează 3-4 ore.
Aceste insuline pot fi administrate imediat înainte și după mese. Odată cu introducerea insulinelor ultra-scurte înainte de mese, nu este necesar să se mențină o pauză între injecție și masă.

Insulinele ultra-scurte nu necesită gustări suplimentare în timpul acțiunii de vârf, ceea ce le face mai convenabile decât cele scurte.

Insulinele ultra-scurte includ Apidra, Novo-Rapid, Humalog.

• Insuline scurte

Insulinele scurte își încep efectul în 20-30 de minute, vârful acțiunii are loc în 2-3 ore, durata acțiunii este de aproximativ 5-6 ore.
Insulinele scurte sunt administrate înainte de masă, de obicei o pauză de 10-15 minute între injecție și începutul mesei.

Când utilizați insuline scurte, trebuie să luați o gustare la 2-3 ore după injectare, timpul gustării ar trebui să coincidă cu momentul vârfului acțiunii insulinei.

Insulinele scurte includ Actrapid, Himulin Regular, Monodar (K50, K30, K15), Insuman Rapid, Humodar etc.

• Insuline de durată medie

Acest grup include insuline, care au o acțiune destul de lungă, de aproximativ 12-16 ore.

De obicei, în diabetul de tip 1, aceste insuline sunt utilizate ca insuline bazale sau de fond. Necesită două (uneori trei) injecții pe zi, de obicei dimineața și seara cu un interval de 12 ore.

Aceste insuline încep să funcționeze în 1-3 ore, ating vârful în 4-8 (în medie) ore și durează aproximativ 12-16 ore.

Insulinele cu acțiune medie includ insuline precum Protafan, Humulin NPH, Humodar br, Insuman Bazal, Novomix.

• Insuline cu acțiune îndelungată

Aceste insuline acționează ca insulină de bază sau insulină bazală. Este necesară o injecție (uneori două) pe zi.
Insulinele cu acțiune îndelungată sunt utilizate pentru terapia cu insulină pentru diabetul de tip 2.

Dozajul lor este cumulativ, adică atunci când se modifică doza de administrare, efectul va fi complet vizibil în 2-3 zile.

Insulinele prelungite încep să funcționeze la 4-6 ore după administrare, vârful activității atinge 10-14 ore, acțiunea lor durează 20-24 ore.
Printre insulinele cu acțiune prelungită există insuline „fără vârf”, adică nu dau un vârf pronunțat, prin urmare acționează mai blând și într-o măsură mai mare imită acțiunea insulinei endogene la o persoană sănătoasă.

Insulinele cu acțiune lungă includ Lantus, Monodar Long și Monodar ultralong, Ultralente, Ultralong, Humulin L etc.
Insulinele fără vârf includ Levemir, Lantus.

Tip insulină	Caracteristică
	Începutul acțiunii	Acțiune de vârf	Durata acțiunii
Ultrascurt
Mic de statura	20-30 minute
Mijloc			12-16 ore
Prelungit		10-14 ore

Insulina este un hormon care joacă un rol critic în funcționarea normală a corpului uman. Este produs de celulele pancreasului și promovează absorbția glucozei, care este principala sursă de energie și principalul aliment pentru creier.

Dar, uneori, dintr-un motiv sau altul, secreția de insulină în organism este redusă vizibil sau se oprește cu totul, cum să fii și cum să ajuti. Acest lucru duce la întreruperea severă a metabolismului glucidic și la dezvoltarea unei boli atât de periculoase precum diabet.

Fără un tratament adecvat și în timp util, această boală poate duce la consecințe grave, inclusiv pierderea vederii și a membrelor. Singura modalitate de a preveni dezvoltarea complicațiilor este injecțiile regulate de insulină obținută artificial.

Dar din ce este făcută insulina pentru diabetici și cum afectează corpul pacientului? Aceste întrebări sunt de interes pentru multe persoane diagnosticate cu diabet. Pentru a înțelege acest lucru, este necesar să se ia în considerare toate metodele de obținere a insulinei.

Soiuri

Preparatele moderne de insulină diferă în următoarele moduri:

• Sursa de origine;
• Durata acțiunii;
• pH-ul soluției (acid sau neutru);
• Prezența conservanților în compoziție (fenol, crezol, fenol-crezol, metilparaben);
• Concentrația de insulină - 40, 80, 100, 200, 500 U / ml.

Aceste semne afectează calitatea medicamentului, costul acestuia și gradul de efect asupra organismului.

Surse

Nivelul zahărului

În funcție de sursa de primire, preparatele de insulină sunt împărțite în două grupe principale:

Animale. Se obțin din pancreasul bovinelor și porcilor. Ele pot fi nesigure, deoarece provoacă adesea reacții alergice severe. Acest lucru este valabil mai ales pentru insulina bovină, care conține trei aminoacizi necaracteristici pentru oameni. Insulina de porc este mai sigură, deoarece diferă de un singur aminoacid. Prin urmare, este mai des utilizat în tratamentul diabetului zaharat.

Uman. Acestea sunt de două tipuri: analoage umane sau semi-sintetice, obținute din insulina porcină prin transformare enzimatică și umane sau ADN-recombinante, care sunt produse de bacteriile E. coli datorită progreselor în ingineria genetică. Aceste preparate de insulină sunt complet identice cu hormonul produs de pancreasul uman.

Astăzi, insulina de origine umană și animală este utilizată pe scară largă în tratamentul diabetului zaharat. Producția modernă de insulină animală presupune cel mai înalt grad de purificare a medicamentelor.

Acest lucru ajută la eliminarea impurităților nedorite, cum ar fi proinsulina, glucagonul, somatostatina, proteinele, polipeptidele, care pot provoca reacții adverse grave.

Cel mai bun medicament de origine animală este considerat a fi insulina mono-vârf modernă, adică produsă cu eliberarea insulinei „de vârf”.

Durata acțiunii

Producția de insulină se realizează folosind diferite tehnologii, ceea ce face posibilă obținerea de medicamente cu durată de acțiune diferită, și anume:

• acțiune ultracurtă;
• acțiune scurtă;
• acțiune prelungită;
• durata medie a acțiunii;
• actiune de lunga durata;
• acțiune combinată.

Insuline cu acțiune ultra-scurtă. Aceste preparate de insulină diferă prin faptul că încep să acționeze imediat după injecție și ajung la vârf după 60-90 de minute. Timpul lor total de acțiune nu depășește 3-4 ore.

Există două tipuri principale de insulină cu acțiune ultra-scurtă - Lizpro și Aspart. Obținerea insulinei Lizpro se realizează prin rearanjarea a două reziduuri de aminoacizi din molecula hormonală, și anume lizină și prolină.

Datorită unei astfel de modificări a moleculei, este posibilă evitarea formării de hexameri și accelerarea descompunerii acesteia în monomeri și, prin urmare, îmbunătățirea absorbției insulinei. Acest lucru vă permite să obțineți un preparat de insulină care pătrunde în fluxul sanguin al pacientului de trei ori mai repede decât insulina umană naturală.

O altă insulină cu acțiune ultra-scurtă este Aspart. Metodele de obținere a insulinei Asparta sunt în multe feluri similare cu producția de Lizpro, doar în acest caz prolina este înlocuită cu acid aspartic încărcat negativ.

Pe lângă Lispro, Aspart se descompune rapid în monomeri și, prin urmare, este absorbit în sânge aproape instantaneu. Toate preparatele de insulină cu acțiune ultra-scurtă pot fi administrate imediat înainte de mese sau imediat după administrarea lor.

Insuline cu acțiune scurtă. Aceste insuline sunt soluții tampon cu pH neutru (6,6 - 8,0). Se recomandă administrarea acestora, dar, dacă este necesar, este permisă utilizarea de injecții intramusculare sau picături.

Aceste preparate de insulină încep să acționeze în decurs de 20 de minute de la intrarea în organism. Acțiunea lor durează relativ scurt - nu mai mult de 6 ore și atinge maximum după 2 ore.

Insulinele cu acțiune scurtă sunt produse în principal pentru tratamentul pacienților cu diabet zaharat în spital. Acestea ajută în mod eficient pacienții cu coma diabetică și comă paroxistică. În plus, acestea vă permit să determinați cel mai exact doza necesară de insulină pentru pacient.

Insuline de durată medie. Aceste medicamente se dizolvă mult mai rău decât insulinele cu acțiune scurtă. Prin urmare, ele furnizează sânge mai lent, ceea ce crește semnificativ efectul lor hipoglicemiant.

Obținerea insulinei cu durata medie de acțiune se realizează prin introducerea unui prelungitor special în compoziția lor - zinc sau protamină (izofan, protafan, bazal).

Astfel de preparate de insulină sunt produse sub formă de suspensii, cu o anumită cantitate de cristale de zinc sau protamină (cel mai adesea protamină Hagedorn și izofan). Prelungitorii cresc semnificativ timpul de absorbție a medicamentului din țesutul subcutanat, ceea ce crește semnificativ timpul de intrare a insulinei în sânge.

Insuline cu acțiune îndelungată. Aceasta este cea mai modernă producție de insulină care a devenit posibilă datorită dezvoltării tehnologiei recombinante a ADN-ului. Primul medicament cu insulină cu acțiune îndelungată a fost Glargin, care este un analog exact al hormonului produs de pancreasul uman.

Pentru a o obține, se efectuează o modificare complexă a moleculei de insulină, implicând înlocuirea asparaginei cu glicină și adăugarea ulterioară a două reziduuri de arginină.

Glarginul este produs sub formă de soluție transparentă cu un pH acid caracteristic 4. Acest pH face posibilă stabilizarea hexamerilor de insulină și, prin urmare, asigură o absorbție predictibilă și pe termen lung a medicamentului în sângele pacientului. Cu toate acestea, datorită pH-ului său acid, Glargin nu este recomandat să fie combinat cu insuline cu acțiune scurtă, care sunt în general neutre la pH.

Majoritatea preparatelor de insulină au așa-numitul „vârf de acțiune”, la atingerea căreia se observă cea mai mare concentrație de insulină în sângele pacientului. Cu toate acestea, caracteristica principală a Glargin este că nu are un vârf clar de acțiune.

Doar o singură injecție de medicament pe zi este suficientă pentru a oferi pacientului un control glicemic fiabil fără vârf pentru următoarele 24 de ore. Acest lucru se realizează datorită faptului că Glargin este absorbit din țesutul subcutanat în același ritm pe întreaga perioadă de acțiune.

Medicamentele cu insulină cu acțiune îndelungată sunt produse sub diferite forme și pot oferi unui pacient un efect hipoglicemiant timp de până la 36 de ore la rând. Acest lucru ajută la reducerea semnificativă a numărului de injecții cu insulină pe zi și astfel face viața mult mai ușoară pentru persoanele cu diabet.

Medicamente combinate. Aceste medicamente sunt disponibile sub formă de suspensie, care include o soluție neutră de insulină cu acțiune scurtă și insuline cu acțiune medie cu izofan.

Astfel de medicamente permit pacientului să injecteze insuline de diferite durate de acțiune în corpul său cu o singură injecție și, prin urmare, să evite injecții suplimentare.

Dezinfectarea preparatelor de insulină este de o mare importanță pentru siguranța pacientului, deoarece acestea sunt injectate în corpul său și sunt transportate cu fluxul sanguin către toate organele și țesuturile interne.

Anumite substanțe au un anumit efect bactericid, care se adaugă la compoziția insulinei nu numai ca dezinfectant, ci și ca conservanți. Acestea includ crezolul, fenolul și parabenzoatul de metil. În plus, un efect antimicrobian pronunțat este, de asemenea, caracteristic ionilor de zinc, care fac parte din unele soluții de insulină.

Protecția pe mai multe niveluri împotriva infecției bacteriene, care se realizează prin adăugarea de conservanți și alți agenți antiseptici, previne dezvoltarea multor complicații grave. Într-adevăr, injectarea repetată a unui ac de seringă într-un flacon de insulină ar putea determina infectarea medicamentului cu bacterii patogene.

Cu toate acestea, proprietățile bactericide ale soluției ajută la distrugerea microorganismelor dăunătoare și la menținerea acesteia în siguranță pentru pacient. Din acest motiv, persoanele cu diabet pot folosi aceeași seringă pentru a injecta insulină subcutanată de până la 7 ori la rând.

Un alt avantaj al prezenței conservanților în compoziția insulinei este că nu este nevoie să dezinfectați pielea înainte de o injecție. Dar acest lucru este posibil numai cu utilizarea seringilor speciale de insulină echipate cu un ac foarte subțire.

Trebuie subliniat faptul că prezența conservanților în insulină nu afectează negativ proprietățile medicamentului și este complet sigură pentru pacient.

Concluzie

Astăzi, insulina obținută folosind atât pancreasul animal, cât și metodele moderne de inginerie genetică este folosită pe scară largă pentru a crea un numar mare droguri.

Cele mai preferate pentru terapia zilnică cu insulină sunt insulinele umane recombinate cu ADN foarte purificat, care se caracterizează prin cea mai mică antigenicitate și, prin urmare, practic nu provoacă reacții alergice. În plus, preparatele pe bază de analogi de insulină umană sunt de înaltă calitate și siguranță.

Preparatele de insulină sunt vândute în sticle de sticlă de diferite capacități, sigilate ermetic cu dopuri de cauciuc și acoperite cu laminare din aluminiu. În plus, pot fi achiziționate în seringi speciale pentru insulină, precum și în stilouri pentru seringi, care sunt convenabile în special pentru copii.

În prezent, se dezvoltă în mod fundamental noi forme de preparate de insulină, care vor fi introduse în corp intranazal, adică prin mucoasa nazală.

S-a constatat că prin combinarea insulinei cu un detergent este posibil să se creeze un preparat de aerosoli care să atingă concentrația necesară în sângele pacientului la fel de repede ca și cu injecția intravenoasă. În plus, se dezvoltă noi preparate orale de insulină, care pot fi administrate pe cale orală.

Până în prezent, aceste tipuri de insuline sunt încă în stadiul de dezvoltare sau sunt supuse testelor clinice necesare. Cu toate acestea, este destul de evident că în viitorul apropiat vor exista preparate de insulină care nu vor trebui injectate cu seringi.

Cele mai noi produse pentru insulină vor fi produse sub formă de spray-uri, care pur și simplu trebuie pulverizate pe membrana mucoasă a nasului sau gurii pentru a satisface pe deplin nevoia organismului de insulină.

Trimite-ți munca bună în baza de cunoștințe este simplu. Folosiți formularul de mai jos

Studenții, studenții absolvenți, tinerii oameni de știință care folosesc baza de cunoștințe în studiile și munca lor vă vor fi foarte recunoscători.

postat pe http://www.allbest.ru/

postat pe http://www.allbest.ru/

postat pe http://www.allbest.ru/

MINISTERUL EDUCAȚIEI ȘI ȘTIINȚEI AL REPUBLICII KAZAHSTAN

UNIVERSITATEA AGROTEHNICĂ KAZAKH NUMITĂ DUPĂ S. SEIFULLIN

Departamentul de Microbiologie și Biotehnologie

LUCRU DE CURS

La disciplina „Biotehnologia microorganismelor”

Pe tema: Tehnologia producției de insulină

Completat de: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Verificat de: Akimbaeva A.K (dr.)

Astana - 2013

DEFINIȚII

ABREVIERI ȘI SIMBOLURI

INTRODUCERE

1. Istoria descoperirii

2. Obținerea insulinei în biotehnologie

3. Metode de obținere a insulinei umane

4. Exprimarea proinsulinei în celule E coli

5. Purificarea insulinei

6. Mod de administrare și dozare

CONCLUZIE

LISTA DE REFERINTE

DEFINIȚII

În acest curs, au fost utilizate următoarele definiții:

Purtător de proteine - asigurarea transportului proteinei de fuziune în spațiul periplasmatic al celulei sau mediului de cultură;

Componenta de afinitate facilitează în mod semnificativ izolarea proteinei de fuziune.

Insulină(din lat. insula - insulă) - un hormon de natură peptidică, se formează în celulele beta ale insulelor Langerhans ale pancreasului.

Interleukini - un grup de citokine sintetizate în principal de leucocite (din acest motiv, s-a ales terminația „-leukin”).

Proinsulină- este un precursor al insulinei, sintetizat de celulele B ale aparatului insulei pancreasului.

Cromatogrși fia (din greaca chroma, chromatos - culoare, vopsea) , metoda fizico-chimică de separare și analiză a amestecurilor, bazată pe distribuția componentelor lor între două faze - staționare și mobile (eluant), care curg prin staționare.

Incapsularea

Proteina de fuziune (eng. proteine \u200b\u200bde fuziune, de asemenea himerică, proteină de fuziune) este o proteină obținută prin combinarea a două sau mai multe gene care inițial codificau proteine \u200b\u200bseparate.

Gormdespre ne (din grecescul hormao - pus în mișcare, induc), hormoni, substanțe biologic active produse de glandele endocrine sau glande endocrine și secretate de acestea direct în sânge.

Zahărdiabet- un grup de boli endocrine care se dezvoltă ca urmare a deficitului absolut sau relativ al hormonului insulină.

Incapsularea - un mecanism de limbaj de programare care restricționează accesul la componentele care constituie un obiect (metode și proprietăți), le face private, adică accesibile numai în interiorul obiectului.

Somatostatină - hormonul celulelor delta ale insulelor Langerhans ale pancreasului, precum și unul dintre hormonii hipotalamusului.

Radioimunotest - o metodă pentru determinarea cantitativă a substanțelor biologic active (hormoni, enzime, medicamente etc.) în fluidele biologice, bazată pe legarea competitivă a substanțelor stabile și similare dorite etichetate cu un radionuclid cu sisteme de legare specifice.

ABREVIERI ȘI SIMBOLURI

% - procent

OF - fază inversată

HPLC - cromatografie lichidă de înaltă performanță

IO - schimb de ioni

aDNc - acid desoxiribonucleic complementar

MP - mono-vârf

MC - mono-componentă

FITZ - fenilizotiocianat

INTRODUCERE

Funcția principală a insulinei este de a asigura permeabilitatea membranelor celulare pentru moleculele de glucoză. Într-o formă simplificată, putem spune că nu numai carbohidrații, ci și orice nutrienți sunt definiți în cele din urmă în glucoză, care este utilizată pentru a sintetiza alte molecule care conțin carbon și este singurul combustibil pentru stațiile de energie celulară - mitocondriile. Fără insulină, permeabilitatea membranei celulare pentru glucoză scade de 20 de ori, iar celulele mor de foame, iar excesul de zahăr dizolvat în sânge otrăvește corpul.

Întreruperea secreției de insulină datorată distrugerii celulelor beta - deficit absolut de insulină - este o verigă cheie în patogeneza diabetului zaharat de tip 1. Întreruperea acțiunii insulinei asupra țesuturilor - deficit relativ de insulină - are un loc important în dezvoltarea diabetului zaharat de tip 2.

Utilizarea cromatografiei de afinitate a redus semnificativ conținutul de proteine \u200b\u200bcontaminante cu o greutate moleculară mai mare în preparat decât cel al insulinei. Aceste proteine \u200b\u200binclud proinsulina și proinsulinele parțial clivate, care sunt capabile să inducă producerea de anticorpi anti-insulină.

Utilizarea insulinei umane încă de la începutul terapiei minimizează apariția reacțiilor alergice. Insulina umană este absorbită mai repede și, indiferent de forma medicamentului, are o durată de acțiune mai mică decât insulinele animale. Insulinele umane sunt mai puțin imunogene decât insulele porcine, în special insulele mixte de bovine și porcine.

Scopul acestui curs este de a studia tehnologia producției de insulină. Pentru a realiza următoarele sarcini au fost stabilite:

1. producția de insulină în biotehnologie

2.pentru a obține insulină

H. purificarea insulinei

1. Istoria descoperirilor

Istoria descoperirii insulinei este asociată cu numele medicului rus I.M. Sobolev (a doua jumătate a secolului al XIX-lea), care a dovedit că nivelul zahărului din sângele uman este reglat de un hormon special al pancreasului.

În 1922, insulina izolată din pancreasul unui animal a fost administrată pentru prima dată unui băiețel de zece ani, un pacient cu diabet zaharat, rezultatul a depășit toate așteptările, iar un an mai târziu o firmă americană „Eli Lilly” a lansat primul preparat de insulină animal.

După ce a primit primul lot comercial de insulină în următorii câțiva ani, a fost parcursă o cale uriașă pentru izolare și purificare. Ca urmare, hormonul a devenit disponibil pentru pacienții cu diabet zaharat de tip 1.

În 1935, cercetătorul danez Hagedorn a optimizat acțiunea insulinei în organism, propunând un medicament cu acțiune îndelungată.

Primele cristale de insulină au fost obținute în 1952, iar în 1954 biochimistul englez G. Sanger a descifrat structura insulinei. Dezvoltarea metodelor de purificare a hormonului din alte substanțe hormonale și produse de degradare a insulinei a făcut posibilă obținerea unei insuline omogene numite insulină cu un singur component.

La începutul anilor '70. Oamenii de știință sovietici A. Yudaev și S. Shvachkin au propus o sinteză chimică a insulinei, dar implementarea acestei sinteze la scară industrială a fost costisitoare și neprofitabilă.

În viitor, a existat o îmbunătățire progresivă a gradului de purificare a insulinei, care a redus problemele cauzate de alergia la insulină, afectarea funcției renale, insuficiența vizuală și rezistența imună la insulină. Ceea ce era necesar era cel mai eficient hormon pentru terapia de substituție în diabetul zaharat - insulina omologă, adică insulina umană.

În anii 80, progresele în biologia moleculară au făcut posibilă sintetizarea folosind E coli ambele lanțuri de insulină umană, care au fost apoi combinate într-o moleculă de hormon biologic activ, și insulină recombinantă au fost obținute la Institutul de Chimie Bioorganică al Academiei Ruse de Științe folosind tulpini modificate genetic E coli.

2 . Producția de insulină în biotehnologie

Insulina, un hormon peptidic al insulelor Langerhans din pancreas, este tratamentul principal pentru diabet. Această boală este cauzată de un deficit de insulină și se manifestă printr-o creștere a nivelului de glucoză din sânge. Până de curând, insulina era obținută din pancreasul bovin și porcin. Medicamentul a diferit de insulina umană prin 1-3 substituții de aminoacizi, astfel că a existat o amenințare de reacții alergice, în special la copii. Utilizarea terapeutică pe scară largă a insulinei a fost constrânsă de costurile ridicate și de resursele limitate. Prin modificări chimice, insulina de la animale a fost făcută indistinctă de om, dar aceasta a însemnat o creștere suplimentară a prețului produsului.

Companie Eli Lilly din 1982 produce insulină modificată genetic pe baza sintezei separate E. colieCircuite A - și B. Costul produsului a scăzut semnificativ, insulina obținută este identică cu cea a unui om. Din 1980, au apărut rapoarte în presă despre clonarea genei proinsulinei, un precursor al unui hormon care se transformă într-o formă matură cu proteoliză limitată.

Tehnologia încapsulării se aplică și în tratamentul diabetului: celulele pancreasului dintr-o capsulă, injectate o dată în corpul pacientului, produc insulină timp de un an.

Companie Integrat Genetica a lansat producția de hormoni foliculostimulanți și luteinizanti. Aceste peptide sunt compuse din două subunități. Pe ordinea de zi se pune problema sintezei industriale a hormonilor oligopeptidici ai sistemului nervos - encefaline, construite din 5 reziduuri de aminoacizi, și endorfine, analogi ai morfinei. Atunci când sunt utilizate rațional, aceste peptide ameliorează durerea, creează o bună dispoziție, cresc eficiența, concentrează atenția, îmbunătățesc memoria și ordonează somnul și starea de veghe. Un exemplu de aplicare cu succes a metodelor de inginerie genetică este sinteza β-endorfinei folosind tehnologia hibridă a proteinelor descrisă mai sus pentru un alt hormon peptidic, somatostatina.

3 . Metode de obținere a insulinei umane

Din punct de vedere istoric, prima modalitate de a obține insulină în scopuri terapeutice este izolarea analogilor acestui hormon din surse naturale (insulele pancreasului bovinelor și porcilor). În anii 20 ai secolului trecut, s-a constatat că insulinele bovine și porcine (care sunt cele mai apropiate de insulina umană în structura și secvența de aminoacizi) prezintă activitate în corpul uman comparabilă cu insulina umană. După aceea, pentru o lungă perioadă de timp, insulinele bovine sau porcine au fost utilizate pentru a trata pacienții cu diabet zaharat de tip I. Cu toate acestea, după un timp s-a demonstrat că, în unele cazuri, anticorpii împotriva insulinei bovine și porcine încep să se acumuleze în corpul uman, anulând astfel efectul acestora.

Pe de altă parte, unul dintre avantajele acestei metode pentru producerea insulinei este disponibilitatea materiilor prime (insulina bovină și porcină poate fi ușor obținută în cantități mari), care a jucat un rol decisiv în dezvoltarea primei metode de producere a insulinei umane. Această metodă se numește semi-sintetică.

În această metodă de producere a insulinei umane, insulina de porc a fost utilizată ca materie primă. Octapeptida C-terminală a lanțului B a fost clivată din insulina porcină purificată, după care octapeptida C-terminală a insulinei umane a fost sintetizată. Apoi a fost atașat chimic, deprotejat și insulina rezultată a fost purificată. La testarea acestei metode de obținere a insulinei, s-a arătat identitatea completă a hormonului obținut cu insulina umană. Principalul dezavantaj al acestei metode este costul ridicat al insulinei rezultate (chiar și acum, sinteza chimică a unei octapeptide este o plăcere costisitoare, mai ales la scară industrială).

În prezent, insulina umană se obține în principal în două moduri: prin modificarea insulinei porcine printr-o metodă sintetic-enzimatică și printr-o metodă modificată genetic.

În primul caz, metoda se bazează pe faptul că insulina porcină diferă de insulina umană printr-o substituție la capătul C al lanțului B Ala30Thr... Înlocuirea alaninei cu treonina se realizează prin scindarea catalizată de enzime a alaninei și prin adăugarea unui rest de treonină protejat carboxil, care este prezent în amestecul de reacție în exces mare, în locul său. După scindarea grupării protectoare O-terț-butil, se obține insulina umană. (poza 1)

Figura 1 - Schema metodelor de obținere a insulinei umane

Insulina a fost prima proteină disponibilă comercial folosind tehnologia ADN-ului recombinant. Există două abordări principale pentru obținerea insulinei umane modificată genetic. În primul caz, se realizează separat (tulpini de producător diferite) care obțin ambele lanțuri, urmat de plierea moleculei (formarea de punți disulfură) și separarea misoformelor. În al doilea, obținerea sub forma unui precursor (proinsulina), urmată de scindarea enzimatică cu tripsină și carboxipeptidază. B la forma activă a hormonului. În prezent, cea mai preferată este producerea de insulină sub forma unui precursor, care asigură închiderea corectă a punților disulfură (în cazul producției separate a lanțurilor, se efectuează cicluri succesive de denaturare, separarea misoformelor și renaturare.

Cu ambele abordări, este posibil atât obținerea individuală a componentelor inițiale (lanțurile A și B sau proinsulina), cât și ca parte a proteinelor de fuziune. În plus față de lanțurile A și B sau proinsulina, proteinele de fuziune pot conține:

1) proteină purtătoare - asigurarea transportului proteinei de fuziune în spațiul periplasmatic al celulei sau mediului de cultură;

2) o componentă de afinitate, care facilitează foarte mult izolarea proteinei de fuziune.

Mai mult, ambele componente pot fi prezente simultan în proteina de fuziune. În plus, la crearea proteinelor de fuziune, poate fi utilizat principiul multimeric (adică, mai multe copii ale polipeptidei țintă sunt prezente în proteina de fuziune), ceea ce poate crește semnificativ randamentul produsului țintă.

4 . Exprimarea proinsulinei în celuleE coli

Am folosit tulpina JM 109 N1864 cu o secvență de nucleotide inserată într-o plasmidă care exprimă o proteină de fuziune, care constă din proinsulină liniară și un fragment de proteină atașat la capătul său N-terminal printr-un reziduu de metionină ȘIStaphylococcus aureus. Cultivarea biomasei saturate a celulelor tulpinei recombinante oferă începutul producerii proteinei hibride, a cărei izolare și transformare secvențială intube duce la insulină. Un alt grup de cercetători a primit o proteină recombinantă de fuziune în sistemul de expresie bacteriană, constând din proinsulină umană și o „coadă” de polihistidină atașată la aceasta prin reziduul de metionină. A fost izolat folosind cromatografie chelată pe corpuri de incluziune a Ni-agarozei și a fost digerat cu bromură de cianogen. Autorii au stabilit că proteina izolată este S-sulfonată. Cartografierea și analiza spectrometrică de masă a proinsulinei obținute, purificată prin cromatografie cu schimb de ioni pe schimbător de anioni și HPP (fază inversă) HPLC (cromatografie lichidă de înaltă performanță), a arătat prezența punților disulfurice corespunzătoare punților disulfurice ale proinsulinei umane native. De asemenea, este raportat despre dezvoltarea unei noi metode îmbunătățite pentru producerea insulinei umane prin inginerie genetică în celulele procariote. Autorii au descoperit că insulina rezultată este identică în structură și activitate biologică cu hormonul secretat din pancreas.

Recent, o atenție deosebită a fost acordată simplificării procedurii pentru obținerea insulinei recombinante utilizând metode de inginerie genetică. Astfel, s-a obținut o proteină de fuziune, constând dintr-o peptidă lider interleukină atașată la capătul N-terminal al proinsulinei printr-un reziduu de lizină. Proteina a fost eficient exprimată și localizată în corpurile de incluziune. După izolare, proteina a fost scindată cu tripsină pentru a produce insulină și peptidă C. Un alt grup de cercetători a acționat în mod similar. O proteină de fuziune constând din proinsulină și două domenii sintetice de proteină A stafilococice care se leagă IgG, localizate în corpurile de incluziune, dar au avut un nivel mai ridicat de exprimare. Proteina a fost izolată prin cromatografie de afinitate folosind IgG și a fost tratat cu tripsină și carboxipeptidază B. Insulina și peptida C rezultate au fost purificate prin HPP RP. Atunci când se creează structuri de fuziune, raportul dintre masa proteinei purtătoare și polipeptida țintă este foarte important. Acesta este modul în care este descrisă construcția de fuziuni, unde proteina umană de legare a albuminei serice a fost utilizată ca polipeptidă purtătoare. La acesta s-au atașat una, trei și șapte peptide C. C-peptidele au fost legate pe o bază cap-coadă folosind distanțieri de aminoacizi care transportă un situs de restricție Sfi I și două reziduuri de arginină la începutul și la sfârșitul distanțierului pentru digestia ulterioară a tripsinei proteinei. HPLC a produselor de scindare a arătat că scindarea peptidei C este cantitativă și acest lucru face posibilă utilizarea metodei genelor sintetice multimerice pentru a obține polipeptide țintă la scară industrială.

Obținerea unui mutant proinsulinic care conținea o substituție Arg32Tyr... Scindarea articulară a acestei proteine \u200b\u200bcu tripsină și carboxipeptidază B a dus la formarea insulinei native și a peptidei C care conțin un reziduu de tirozină. Acesta din urmă, după etichetarea cu 125I, este utilizat în mod activ în testele radioimunologice.

5 . Purificarea insulinei

Insulina pentru fabricarea medicamentelor trebuie să aibă o puritate ridicată. Prin urmare, un control extrem de eficient asupra purității produselor rezultate este necesar în fiecare etapă a producției. Anterior, au fost caracterizate folosind HPP RP și IO (schimb ionic), S-sulfonatul de proinsulină, proinsulina, lanțurile A- și B individuale și S-sulfonatul lor. De asemenea, se acordă o atenție specială derivaților fluorescenți ai insulinei. În această lucrare, autorii au investigat aplicabilitatea și informativitatea metodelor cromatografice în analiza produselor din toate etapele producției de insulină umană și au elaborat o procedură pentru operațiile cromatografice care face posibilă separarea și caracterizarea eficientă a produselor obținute. Autorii au separat derivații de insulină folosind absorbanți bifuncționali (HPLC hidrofob și cu schimb de ioni RP HPLC) și au arătat posibilitatea de a controla selectivitatea separării prin variația contribuției fiecăreia dintre interacțiuni, realizând astfel o eficiență mai mare în separarea analogilor proteici apropiați. În plus, se dezvoltă abordări pentru automatizarea și accelerarea proceselor de determinare a purității și cantității de insulină. Lucrarea raportează studii privind posibilitatea utilizării cromatografiei lichide RP cu detecție electrochimică pentru determinarea insulinei și a fost dezvoltată o metodă pentru determinarea insulinei izolate din insula Langerhans prin cromatografie de imunoaffinitate cu detecție spectrometrică. Lucrarea a investigat posibilitatea utilizării microdeterminării rapide a insulinei utilizând electroforeza capilară cu detectare cu fluorescență laser. Analiza se efectuează prin adăugarea unei cantități cunoscute de insulină marcată cu fenil izotiocianat (FITC) și a unui fragment Fab anticorpi monoclonali împotriva insulinei. Insulinele etichetate și convenționale intră competitiv într-o reacție complexă de formare cu Fab. Insulina marcată FITC și complexul acesteia cu Fab separat în 30 de secunde.

Recent, un număr mare de lucrări au fost dedicate îmbunătățirii metodelor de producere a insulinei, precum și creării de forme de dozare pe baza acesteia. De exemplu, în SUA au brevetat analogi hepatospecifici ai insulinei, care sunt diferiți structural de hormonul natural datorită introducerii altor resturi de aminoacizi la pozițiile 13-15 și 19 ale lanțului A și la poziția 16 ale lanțului B. Analogii obținuți sunt utilizați în diferite forme de dozare parenterală (intravenoasă, intramusculară, subcutanată), intranazală sau implantare sub formă de capsule speciale în tratamentul diabetului zaharat. Crearea formelor de dozare care se administrează fără injecții este deosebit de relevantă. Este raportat despre crearea unui sistem macromolecular pentru administrare orală, care este insulină imobilizată în volumul unui polimer hidrogel modificat cu inhibitori ai enzimelor proteolitice. Eficacitatea unui astfel de medicament este de 70-80% din eficacitatea insulinei native injectate subcutanat. Într-o altă lucrare, un medicament este preparat printr-o incubare într-o etapă a insulinei cu eritrocite luate într-un raport de 1-4: 100 în prezența unui agent de legare. Autorii raportează primirea unui medicament cu o activitate de 1000 de unități / g, păstrarea completă a activității după administrare orală și depozitare timp de câțiva ani într-o formă liofilizată.

Pe lângă crearea de noi medicamente și forme de dozare pe bază de insulină, se dezvoltă noi abordări pentru rezolvarea problemei diabetului zaharat. Astfel, ADNc-ul proteinei transportoare de glucoză a fost transfectat GLUT2 celule pre-stabilizate transfectate cu ADNc de insulină pe toată lungimea HEP G2 ins... În clonele rezultate HEP G2 Insgl glucoza stimulează secreția normală de insulină și potențează răspunsul secretor la alți stimulatori ai secreției. Microscopia imunoelectronică a relevat granule care conțin insulină, asemănătoare morfologic cu granulele din celulele b ale insulelor Langerhans. În prezent, se discută serios posibilitatea utilizării „celulelor b artificiale” obținute prin metode de inginerie genetică pentru tratamentul diabetului zaharat de tip 1.

Odată cu rezolvarea problemelor practice, sunt studiate mecanismele de acțiune ale insulinei, precum și relațiile structurale și funcționale ale moleculei. Una dintre metodele de cercetare este crearea diferiților derivați de insulină și studiul proprietăților lor fizico-chimice și imunologice. După cum sa menționat mai sus, o serie de metode pentru producerea insulinei se bazează pe producerea acestui hormon sub forma unui precursor (proinsulină), urmată de scindarea enzimatică a insulinei și a peptidei C. În prezent, prezența activității biologice a fost demonstrată pentru peptida C, ceea ce face posibilă utilizarea acesteia în scopuri terapeutice împreună cu insulina. Următoarele articole din această serie vor lua în considerare proprietățile fizico-chimice și biologice ale peptidei C, precum și metodele de preparare a acesteia.

Contribuția biotehnologiei la productie industriala hormoni non-peptidici, în principal steroizi. Tehnicile de transformare microbiologică au redus dramatic numărul de etape în sinteza chimică a cortizonului, un hormon suprarenal utilizat pentru tratarea artritei reumatoide. În producția de hormoni steroizi, celulele microbiene imobilizate sunt utilizate pe scară largă, de exemplu Arthrobacterglobiformis, pentru sinteza prednisolonului din hidrocortizon. Există evoluții privind producția hormonului tiroidian tiroxină din microalge.

Prin gradul de purificare

· tradiţional - extrase cu etanol acid, iar în timpul procesului de purificare sunt filtrate, sărate și cristalizate de mai multe ori (metoda nu permite curățarea preparatului de impuritățile altor hormoni conținuți în pancreas)

· Mono-peak (MP) - după purificarea tradițională, acestea sunt filtrate pe un gel (în timpul cromatografiei pe gel, formează un singur "peak": conținutul de impurități de mai sus nu este mai mare de 1 × 10 × 3

Mono-component (MC) - sunt supuse unei purificări și mai profunde utilizând o sită moleculară și cromatografie cu schimb de ioni pe DEAE-celuloza, ceea ce face posibilă obținerea a 99% din puritatea lor (1 10-6) (Figura 2)

Figura 2 - Schema de purificare a insulinei

biotehnologie insulină diabet zaharat

6 . Mod de administrare și dozare

Determinat și reglementat strict sub supraveghere medicală în conformitate cu starea pacientului. Toate preparatele de humulin pot fi administrate subcutanat sau intravenos; Humulin R în fiole se administrează intravenos. Administrarea subcutanată, preferată de pacienți, trebuie să se facă în brațul superior, coapsa, fesele sau regiunea abdominală. Locurile de injectare trebuie schimbate astfel încât aceeași parte a corpului să fie utilizată nu mai mult de o dată pe lună. Capilarele nu trebuie afectate. Locul injectării nu necesită masaj. Cartușele Humulin sunt utilizate numai pentru injectare în spumele Becton Dickinson. În acest caz, este necesar să respectați cu atenție instrucțiunile producătorului notate pe spume la umplerea și aplicarea acestora. Pacienții trebuie să aibă întotdeauna la îndemână o seringă de rezervă și o fiolă de humulină, în cazul în care dispozitivul de injecție Pen sau cartușul se pierd. Profiluri de acțiune Humulin. Humulin R: debutul acțiunii în 10 minute, acțiunea maximă - între 1 și 3 ore, durata acțiunii - de la 5 la 7 ore. Humulin N: debutul acțiunii - după 30 de minute, acțiunea maximă - între 2 și 8 ore, durata acțiunii - de la 18 la 20 de ore. Humulin M1: debutul acțiunii - după 30 de minute, acțiunea maximă - între 2 și 9 ore, durata acțiunii - de la 16 la 18 ore. Humulin M2: debutul acțiunii - după 30 de minute, acțiunea maximă între 1,5 și 9 ore, durata acțiunii - de la 14 la 16 ore. Humulin M3: debutul acțiunii - după 30 de minute, acțiunea maximă - între 1 și 8,5 ore, durata acțiunii - de la 14 la 15 ore. Humulin M4: debutul acțiunii - după 30 de minute, acțiunea maximă - între 1 și 8 ore, durata acțiunii - de la 14 la 15 ore. Humulin L: debutul acțiunii - după 2 ore, acțiunea maximă - între 4 și 16 ore, durata acțiunii - aproximativ 24 de ore. Humulin U: debutul acțiunii - după 3 ore, acțiunea maximă - între 3 și 18 ore, durata acțiunii - de la 24 la 28 de ore. Terapie cu un singur medicament. Humulin R poate fi administrat fără alte tipuri de insulină utilizând mai multe injecții zilnice. Humulin N, L și U pot fi, de asemenea, administrate independent de 1-2 ori pe zi. Terapie combinată. Pentru a spori efectul inițial, unii pacienți, pe lângă humulin R, li se prescriu humuline H, L și U. Utilizarea simultană a insulinelor animale produse de diferite companii nu este recomandată. Humulin M nu necesită terapie combinată; se administrează de două ori pe zi (2/3 din necesarul zilnic dimineața, restul seara). Pentru orice administrare, doza nu trebuie să depășească 50 de unități. Pacienta este obligată să informeze medicul despre sarcină. În această perioadă, este necesară o monitorizare strictă a stării de sănătate a pacientului dependent de insulină. Nevoia de medicament scade de obicei în primul trimestru și crește în al doilea și al treilea. Pacienții cu diabet în timpul alăptării necesită ajustarea dozei de insulină (și a dietei).

CONCLUZIE

Diabetul zaharat este o boală cronică cauzată de un deficit de insulină absolut sau relativ. Se caracterizează prin tulburări metabolice profunde ale glucidelor cu hiperglicemie și glicozurie, precum și alte tulburări metabolice ca urmare a expunerii la o serie de factori genetici și externi.

Insulina servește în continuare ca radical și, în majoritatea cazurilor, singurul mijloc de a menține viața și capacitatea de muncă a pacienților cu diabet. Înainte de a primi și a introduce insulina în clinică în 1922-1923. Pacienții cu diabet zaharat de tip I s-au confruntat cu moartea în decurs de unu până la doi ani de la debutul bolii, în ciuda utilizării celor mai epuizante diete. Pacienții cu diabet zaharat de tip I necesită terapie de substituție pe tot parcursul vieții cu insulină. Întreruperea administrării regulate a insulinei dintr-un motiv sau altul duce la dezvoltarea rapidă a complicațiilor și la moartea timpurie a pacientului.

În prezent, diabetul zaharat se află pe locul trei în ceea ce privește prevalența după bolile cardiovasculare și oncologice. Potrivit Organizației Mondiale a Sănătății, prevalența diabetului zaharat în rândul adulților în majoritatea regiunilor lumii este de 2-5% și există tendința ca numărul pacienților să se dubleze aproape la fiecare 15 ani. În ciuda progresului evident în îngrijirea sănătății, numărul pacienților dependenți de insulină crește în fiecare an și în prezent doar în Rusia este de aproximativ 2 milioane de persoane.

Crearea preparatelor de insulină umană modificată genetic din interior deschide noi posibilități de rezolvare a multor probleme pentru a salva viețile a milioane de oameni care suferă de diabet.

Diabetul zaharat ocupă locul al treilea în lume după bolile cardiovasculare și oncologice. Potrivit diverselor surse, există între 120 și 180 de milioane de persoane cu diabet în lume, ceea ce reprezintă 2-3 la sută din populația totală a planetei. Oamenii de știință prezic că se așteaptă ca numărul pacienților să se dubleze la fiecare 15 ani.

În opinia mea, insulina este unul dintre cei mai studiați hormoni. Au trecut mai bine de 80 de ani de la descoperirea că insulina produsă de pancreas este responsabilă de scăderea nivelului de zahăr din sânge. Cu toate acestea, până în prezent, acest hormon este de mare interes.

LISTA DE REFERINTE

1. Re, L. Optimizarea producției biotehnologice a substanțelor de interferoni umani recombinați; pe. din franceză - M .: Mir, 2002.-S. 140-143.

2. Shevelukha, V. S. Biotehnologie agricolă / V. S. Shevelukha, E. A. Kalashnikova, ediția a IV-a - M .: Editura Școlii Superioare, 2003.-437 p.

3. Smith, Oh. Registrul de stat al medicamentelor; pe. din engleză - M .: Mir, 2003. - S. 37-39.

4. Grișcenko, V. I. Biotehnologia moleculară a interferonilor - 2008.-T. 11, nr. 7.-Harkov. 238.

5. Sadchenko, LS Progresele moderne în biotehnologie în industria medicală. -2008.-M. 31, nr. 5.- L. 213.

6. Biotehnologia modernă [Resursă electronică]: site despre biotehnologie. - Mod de acces: http://www.bionews.ru/news/Bio.htm

7. Mariniva A.K. Producția de substanțe proteice. Biotehnologie - 2007.-T. 51, nr. 5.-SPb. 17.

8.http: //ru.wikipedia.org/wiki/

9.http: //www.medichelp.ru/

10.http: //mikrobio.ho.ua/

Postat pe Allbest.ru

...

Documente similare

Asigurarea permeabilității membranelor celulare pentru moleculele de glucoză cu insulină - un hormon de natură peptidică. Reacții la preparatele de insulină: rezistență imunologică la insulină, alergie, lipodistrofie. Obținerea insulinei, o varietate de preparate.

rezumat, adăugat 02/05/2010


Istoria creării și mecanismului de acțiune al insulinei, care este un hormon proteic-peptidic produs de celulele insulelor Langerhans din pancreas. Metode de primire. Dezavantaje ale insulinei animale. Beneficiile insulinei biotehnologice.

prezentare adăugată 15.03.2016


Etiologie și patogenie, clasificarea diabetului zaharat, insulinoterapie. Farmacocinetica preparatelor de insulină, interacțiunea sa cu alte medicamente. Bucal și sublingual, căi de inhalare de livrare în corpul uman.

teză, adăugată 16/10/2014


Îmbunătățirea calității vieții pacienților cu diabet zaharat. Calculul compoziției dietei. Prescrierea insulinei, calcularea dozei acesteia, distribuția insulinei pe tot parcursul zilei. Biosinteza insulinei și procesele de secreție. Aplicarea curentului sinusoidal modulat.

prezentare adăugată în 20/10/2014


Studiul structurii și acțiunii insulinei. Secreția și sinteza glucogonei. Examinarea simptomelor și diagnosticarea diabetului zaharat. Caracteristicile bolilor sistemului endocrin. Utilizarea medicamentelor și a substanțelor chimice în tratamentul bolilor.

prezentare adăugată la 10/12/2015


Conceptul și funcția hormonilor. Transformarea microbiologică a steroizilor industriali. Materii prime pentru sinteza hormonilor steroizi. Metoda de inginerie genetică pentru obținerea somatostatinei. Crearea insulinei pe baza tehnologiei ADN-ului recombinant.

prezentare adăugată pe 22.12.2016


Caracteristici ale tratamentului diabetului zaharat de tip I. Utilizarea dietei, exercițiilor fizice, insulinoterapiei. Criterii de compensare a diabetului. Recomandări pentru regimul activității fizice. Supradozaj cronic cu insulină (sindrom Somoji).

prezentare adăugată 23.09.2016


Etiologie și manifestari clinice diabetul zaharat. Tipuri de insulină, reguli de păstrare. Conceptul și schemele terapiei cu insulină. Studiul complicațiilor după injectarea insulinei. Rolul asistentei medicale în educația pacienților cu diabet zaharat.

hârtie la termen, adăugată la 01.06.2016


Încălcarea secreției interne a pancreasului. Caracteristicile simptomelor diabetului zaharat, cazuri de niveluri ridicate de insulină în sânge. Metode de recunoaștere a diferitelor tipuri de hipoglicemie. Ipoteze ale cauzelor deteriorării pancreasului.

rezumat, adăugat 28.04.2010


Evaluarea eficacității tratamentului pentru diabet. Valoarea clinică și diagnostic a glucozei în lichidul cefalorahidian. Principalele caracteristici ale testului de toleranță la glucoză. Curbă după o singură încărcare de glucoză. Curba de secreție de insulină pentru diabetul de gradul II.

Insulina (din latină insula - insulă) este un hormon de natură peptidică, se formează în celulele beta ale insulelor Langerhans ale pancreasului. Are un efect multifacetic asupra metabolismului în aproape toate țesuturile.

Funcția principală a insulinei este de a asigura permeabilitatea membranelor celulare pentru moleculele de glucoză. Într-o formă simplificată, putem spune că nu numai carbohidrații, ci și orice nutrienți sunt descompuși în cele din urmă în glucoză, care este utilizată pentru a sintetiza alte molecule care conțin carbon și este singurul combustibil pentru stațiile de energie celulară - mitocondriile. Fără insulină, permeabilitatea membranei celulare pentru glucoză scade de 20 de ori, iar celulele mor de foame, iar excesul de zahăr dizolvat în sânge otrăvește corpul.

Întreruperea secreției de insulină datorată distrugerii celulelor beta - deficit absolut de insulină - este o verigă cheie în patogeneza diabetului zaharat de tip 1. Întreruperea acțiunii insulinei asupra țesuturilor - deficit relativ de insulină - are un loc important în dezvoltarea diabetului zaharat de tip 2.

Istoria descoperirii insulinei este asociată cu numele medicului rus I.M. Sobolev (a doua jumătate a secolului al XIX-lea), care a dovedit că nivelul zahărului din sângele uman este reglat de un hormon special al pancreasului.

În 1922, insulina izolată din pancreasul unui animal a fost administrată pentru prima dată unui băiețel de zece ani cu diabet. rezultatul a depășit toate așteptările și, un an mai târziu, compania americană Eli Lilly a lansat primul preparat de insulină pentru animale.

După ce a primit primul lot comercial de insulină în următorii câțiva ani, a fost parcursă o cale uriașă pentru izolare și purificare. Ca urmare, hormonul a devenit disponibil pentru pacienții cu diabet zaharat de tip 1.

În 1935, cercetătorul danez Hagedorn a optimizat acțiunea insulinei în organism, propunând un medicament cu acțiune îndelungată.

Primele cristale de insulină au fost obținute în 1952, iar în 1954 biochimistul englez G. Sanger a descifrat structura insulinei. Dezvoltarea metodelor de purificare a hormonului din alte substanțe hormonale și produse de degradare a insulinei a făcut posibilă obținerea unei insuline omogene, numită monocomponent.

La începutul anilor 70. Oamenii de știință sovietici A. Yudaev și S. Shvachkin au propus o sinteză chimică a insulinei, dar implementarea acestei sinteze la scară industrială a fost costisitoare și neprofitabilă.

În viitor, a existat o îmbunătățire progresivă a gradului de purificare a insulinei, care a redus problemele cauzate de alergia la insulină, afectarea funcției renale, insuficiența vizuală și rezistența imună la insulină. A fost nevoie de cel mai eficient hormon pentru terapia de substituție în diabetul zaharat - insulina omologă, adică insulina umană.

În anii 80, progresele în biologia moleculară au făcut posibilă sintetizarea ambelor lanțuri de insulină umană folosind E. coli, care au fost apoi combinate într-o moleculă de hormon biologic activ, iar la Institutul de Chimie Bioorganică, Academia Rusă de Științe, insulina recombinantă a fost obținută folosind tulpini de E. coli modificate genetic.

Utilizarea cromatografiei de afinitate a redus semnificativ conținutul de proteine \u200b\u200bcontaminante cu o greutate moleculară mai mare în preparat decât cel de insulină. Aceste proteine \u200b\u200binclud proinsulina și proinsulinele parțial clivate, care sunt capabile să inducă producerea de anticorpi anti-insulină.

Utilizarea insulinei umane încă de la începutul terapiei minimizează apariția reacțiilor alergice. Insulina umană este absorbită mai repede și, indiferent de forma medicamentului, are o durată de acțiune mai mică decât insulinele animale. Insulinele umane sunt mai puțin imunogene decât insulele porcine, în special insulele mixte de bovine și porcine.

1. Tipuri de insulină

Preparatele de insulină diferă între ele prin gradul de purificare; sursa de primire (bovină, porcină, umană); substanțe adăugate la soluția de insulină (prelungirea acțiunii sale, bacteriostatice etc.); concentraţie; Valoarea pH-ului; posibilitatea de a amesteca ICD cu SPD.

Preparatele de insulină variază în funcție de sursă. Insulina porcină și bovină diferă de insulina umană din compoziția aminoacizilor: insulina bovină în trei aminoacizi și insulina porcină într-unul. În mod surprinzător, reacțiile adverse sunt mult mai frecvente în cazul insulinei bovine decât în \u200b\u200bcazul insulinei porcine sau umane. Aceste reacții sunt exprimate în rezistență imunologică la insulină, alergie la insulină, lipodistrofii (modificări ale grăsimii subcutanate la locul injectării).

În ciuda dezavantajelor clare ale insulinei bovine, este încă utilizată pe scară largă în lume. Și totuși, dezavantajele imunologice ale insulinei bovine sunt evidente: nu este în niciun caz recomandat să o prescrie pacienților cu diabet zaharat nou diagnosticat, femeilor însărcinate sau pentru terapie cu insulină pe termen scurt, de exemplu, în perioada perioperatorie. Calitățile negative ale insulinei bovine persistă chiar și atunci când este utilizată într-un amestec cu carne de porc, de aceea insulina mixtă (carne de porc + bovină) nu ar trebui folosită nici pentru tratamentul acestor categorii de pacienți.

Preparatele de insulină umană sunt complet identice ca structură chimică cu insulina umană.

Principala problemă a metodei biosintetice pentru producerea insulinei umane este purificarea completă a produsului final de la cele mai mici impurități ale microorganismelor utilizate și ale produselor metabolice ale acestora. Noile metode de control al calității asigură faptul că insulinele umane biosintetice de la producătorii de mai sus nu conțin impurități dăunătoare; astfel, gradul lor de purificare și eficiența de reducere a zahărului îndeplinesc cele mai înalte cerințe și sunt practic aceleași. Aceste preparate de insulină nu au efecte secundare nedorite în funcție de impurități.

În prezent, trei tipuri de insulină sunt utilizate în practica medicală:

Acțiune scurtă cu debut rapid al efectului;

Durata medie a acțiunii;

Acțiune îndelungată cu debut lent al efectului.

Tabelul 1. Caracteristicile preparatelor comerciale de insulină

Tip insulină	Sinonime	Extensie	Conservant	Tampon / Săruri		Exemple (nume comerciale)
Actiune scurta	„Simplu”, instantaneu		Metilparaben m-Cresol fenol	NaCl Glicerină Na (H) PO4 Na acetat	Uman. Porc bovin	Actrapid-NM, Humulin-R Actrapid, Actrapid-MS Insulină injectabilă (URSS, nu mai este produsă)
		Protamina	m-Cresol Fenol	Glicerină Na (H) PO4	Uman. Porc bovin	Protafan-NM, Humulin-N Protafan-MS Protamină-insulină (URSS, nu se mai produce)
	Suspensie de insulină zinc (mixtă)		Metilparaben	NaCl acetat de Na	Uman. Porc bovin	Monotard-NM, Humulin-zinc Monotard-MS, Lente-MS Lente
Ultra bandă	Suspensie de insulină zinc (cristal)		Metilparaben	NaCl acetat de Na	Uman. Bullish	Ultralente Ultrahard

Insulina cu acțiune scurtă (CDI) - insulină obișnuită - este o zinc-insulină cristalină cu acțiune scurtă solubilă la pH neutru, al cărei efect se dezvoltă în 15 minute după administrarea subcutanată și durează 5-7 ore.

Prima insulină cu acțiune îndelungată (IPP) a fost dezvoltată la sfârșitul anilor 1930, astfel încât pacienții să poată injecta mai rar decât cu ICD singur - o dată pe zi, dacă este posibil. Pentru a crește durata acțiunii, toate celelalte preparate de insulină sunt modificate și, atunci când sunt dizolvate într-un mediu neutru, formează o suspensie. Acestea conțin protamină într-un tampon fosfat - protamină-zinc-insulină și NPH (protamina neutră a lui Hagedorn) - NPH-insulină sau diverse concentrații de zinc într-un tampon acetat - insuline ultralente, bandă, semilent.

Preparatele de insulină cu acțiune medie conțin protamină, care este o proteină cu masă medie. 4400, bogat în arginină și derivat din lapte de păstrăv curcubeu. Pentru formarea unui complex, este necesar un raport de protamină și insulină de 1:10. după administrarea subcutanată, enzimele proteolitice descompun protamina, permițând absorbția insulinei.

Insulina NPH nu modifică profilul farmacocinetic al insulinei reglatoare amestecată cu aceasta. Insulina NPH este preferată față de banda de insulină ca componentă cu acțiune medie în amestecurile terapeutice care conțin insulină obișnuită.

În tamponul fosfat, toate insulinele cristalizează ușor cu zinc, dar numai cristalele de insulină bovină sunt suficient de hidrofobe pentru a asigura eliberarea lentă și stabilă a insulinei ultralente. Cristalele de zinc de insulină porcină se dizolvă mai repede, efectul apare mai devreme, durata acțiunii este mai scurtă. Prin urmare, nu există un preparat ultralente care să conțină doar insulină de porc. Insulina porcină monocomponentă este produsă sub denumirea de suspensie de insulină, insulină neutră, insulină izofană, insulină aminoquinuridă.

2. Obținerea insulinei

Insulina umană poate fi produsă în patru moduri:

1) sinteza chimică completă;

2) extracția din pancreasul uman (ambele metode nu sunt adecvate datorită proprietăților neeconomice: dezvoltarea insuficientă a primei metode și lipsa materiilor prime pentru producția în masă prin cea de-a doua metodă);

3) printr-o metodă semisintetică utilizând o substituție enzimatic-chimică în poziția 30 a lanțului B al aminoacidului alanină în insulina porcină pentru treonină;

4) metodă biosintetică conform tehnologiei ingineriei genetice. Ultimele două metode produc insulină umană foarte purificată.

În prezent, insulina umană se obține în principal în două moduri: prin modificarea insulinei porcine printr-o metodă sintetic-enzimatică și printr-o metodă modificată genetic.

Insulina a fost prima proteină disponibilă comercial folosind tehnologia ADN-ului recombinant. Există două abordări principale pentru obținerea insulinei umane modificată genetic.

În primul caz, se efectuează prepararea separată (diferite tulpini de producător) a ambelor lanțuri, urmată de plierea moleculei (formarea punților disulfidice) și separarea izoformelor.

În al doilea, obținerea sub formă de precursor (proinsulină) urmată de scindarea enzimatică cu tripsină și carboxipeptidaza B până la forma activă a hormonului. Cel mai preferat în prezent este producția de insulină sub formă de precursor, asigurând închiderea corectă a punților disulfură (în cazul producției separate a lanțurilor, se efectuează cicluri succesive de denaturare, separarea izoformelor și renaturare).

Cu ambele abordări, este posibil atât obținerea individuală a componentelor inițiale (lanțurile A și B sau proinsulina), cât și ca parte a proteinelor de fuziune. În plus față de lanțurile A și B sau proinsulina, proteinele de fuziune pot conține:

Proteină purtătoare, care asigură transportul proteinei de fuziune în spațiul periplasmatic al celulei sau mediului de cultură;

O componentă de afinitate care facilitează foarte mult izolarea proteinei de fuziune.

Mai mult, ambele componente pot fi prezente simultan în proteina de fuziune. În plus, la crearea proteinelor de fuziune, poate fi utilizat principiul multimeric (adică, mai multe copii ale polipeptidei țintă sunt prezente în proteina de fuziune), ceea ce poate crește semnificativ randamentul produsului țintă.

În Marea Britanie, folosind E. coli, au fost sintetizate ambele lanțuri de insulină umană, care au fost apoi combinate într-o moleculă de hormon biologic activ. Pentru ca un organism unicelular să sintetizeze molecule de insulină pe ribozomi, este necesar să-i furnizăm programul necesar, adică să îi introducem gena hormonală.

O genă care programează biosinteza precursorului insulinei sau două gene care programează separat biosinteza lanțurilor de insulină A și B sunt obținute chimic.

Următorul pas este inserarea genei precursorului insulinei (sau a genelor lanțului separat) în genomul E. coli, o tulpină specială de E. coli cultivată în condiții de laborator. Ingineria genetică îndeplinește această sarcină.

Plasmida este izolată din E. coli cu enzima de restricție corespunzătoare. gena sintetică este inserată în plasmidă (prin clonare cu o porțiune C-terminală funcțional activă a E. coli β-galactozidazei). Ca rezultat, E. coli capătă capacitatea de a sintetiza un lanț proteic format din galactozidază și insulină. Polipeptidele sintetizate sunt clivate chimic din enzimă și apoi se efectuează purificarea. La bacterii, sunt sintetizate aproximativ 100.000 de molecule de insulină pe celulă bacteriană.

Natura substanței hormonale produse de E. coli este determinată de gena care este inserată în genomul unui organism unicelular. Dacă gena precursorului insulinei este clonată, bacteria sintetizează precursorul insulinei, care este apoi procesată cu enzime de restricție pentru a cliva prepitida și a izola peptida C, rezultând insulină biologic activă.

Pentru a obține insulină umană purificată, proteina de fuziune izolată din biomasă este supusă transformării chimico-enzimatice și purificării cromatografice adecvate (fundamentală, penetrantă în gel, schimb de anioni).

La Institutul RAS, insulina recombinantă a fost obținută folosind tulpini de E. coli modificate genetic. din biomasa crescută, este izolat un precursor, o proteină hibridă, exprimată într-o cantitate de 40% din proteina celulară totală, care conține preproinsulină. Transformarea sa în insulină in vitro se efectuează în aceeași secvență ca in vivo - polipeptida principală este clivată, preproinsulina este convertită în insulină prin etapele sulfitolizei oxidative urmate de închiderea reductivă a trei legături disulfidice și izolarea enzimatică a peptidei C de legare. După o serie de purificări cromatografice, incluzând schimbul de ioni, gel și HPLC, se obține insulină umană de înaltă puritate și activitate naturală.

Este posibil să se utilizeze o tulpină cu o secvență de nucleotide inserată într-o plasmidă care exprimă o proteină de fuziune care constă din proinsulină liniară și un fragment de proteină Staphylococcus aureus A atașat la capătul său N-terminal prin restul de metionină.

Cultivarea biomasei saturate a celulelor tulpinii recombinante oferă începutul producției de proteine \u200b\u200bde fuziune, a cărei izolare și transformare secvențială în tub duce la insulină.

Un alt mod este, de asemenea, posibil: o proteină recombinantă de fuziune este obținută în sistemul de expresie bacteriană, constând din proinsulină umană și o „coadă” de polihistidină atașată la aceasta prin reziduul de metionină. Se izolează folosind cromatografia pe coloană de chelat Ni-agaroză din corpurile de incluziune și este digerată cu bromură de cianogen.

Proteina izolată este S-sulfonată. Cartografierea și analiza spectrometrică de masă a proinsulinei obținute, purificată prin cromatografie cu schimb de ioni pe schimbător de anioni și HPP (fază inversă) HPLC (cromatografie lichidă de înaltă performanță), arată prezența punților disulfidice corespunzătoare punților disulfidice ale proinsulinei umane native.

Recent, o atenție deosebită a fost acordată simplificării procedurii pentru obținerea insulinei recombinante utilizând metode de inginerie genetică. De exemplu, poate fi obținută o proteină de fuziune constând dintr-o peptidă lider interleukină 2 atașată la capătul N-terminal al proinsulinei printr-un reziduu de lizină. Proteina este eficient exprimată și localizată în corpurile de incluziune. După izolare, proteina este scindată de tripsină pentru a produce insulină și peptidă C.

Insulina rezultată și peptida C au fost purificate prin RP HPLC. Atunci când se creează structuri de fuziune, raportul dintre masa proteinei purtătoare și polipeptida țintă este foarte important. Peptidele C sunt legate într-un mod cap-coadă folosind distanțieri de aminoacizi care poartă un situs de restricție Sfi I și două reziduuri de arginină la începutul și la sfârșitul distanțierului pentru digestia ulterioară a tripsinei proteinei. HPLC a produselor de scindare arată că scindarea peptidei C este cantitativă și acest lucru permite utilizarea metodei genelor sintetice multimerice pentru a obține polipeptide țintă la scară industrială.

1. Biotehnologie: Manual pentru licee / Ed. N.S. Egorova, V.D. Samuilov. - M.: Școala superioară, 1987, pp. 15-25.

2. Insulină umană modificată genetic. Îmbunătățirea eficienței separării cromatografice utilizând principiul bifuncționalității. / Romanchikov A.B., Yakimov S.A., Klyushnichenko V.E., Arutunyan A.M., Vulfson A.N. // Chimie bioorganică, 1997 - 23, № 2

3. Glick B., Pasternak J. Biotehnologie moleculară. Principii și aplicații. M.: Mir, 2002.

4. Egorov NS, Samuilov VD Metode moderne de creare a tulpinilor industriale de microorganisme // Biotehnologie. Carte. 2.M.: Școala superioară, 1988.208 p.

5. Imobilizarea tripsinei și carboxipeptidazei B pe silice modificate și utilizarea lor în conversia proinsulinei umane recombinate în insulină. / Kudryavtseva N.E., Zhigis L.S., Zubov V.P., Wolfson A.I., Maltsev K.V., Rumsh L.D. // Chimice-farmaceutice. Zh., 1995 - 29, nr. 1 pp. 61 - 64.

6. Biologie moleculară. Structura și funcția proteinelor. / Stepanov V.M. // Moscova, Școala Superioară, 1996.

7. Fundamentele biotehnologiei farmaceutice: manual / T.P. Prischep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mihalev. - Rostov-on-Don.: Phoenix; Tomsk: Editura NTL, 2006.

8. Sinteza fragmentelor de insulină și studiul proprietăților lor fizico-chimice și imunologice. / Panin L.E., Tuzikov F.V., Poteryaeva O.N., Maksyutov A.Z., Tuzikova N.A., Sabirov A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997 - 23, No. 12 pp. 953 - 960.