Визначення амінокислотного складу. Дослідження первинної структури білків та пептидів Визначення амінокислотного складу білків
Синтез білка відбувається на рибосомах як первинної структури, тобто. розташованих у певній кількості та певній послідовності амінокислот, з'єднаних пептидними зв'язками, утвореними карбоксильною та α-аміногрупами сусідніх амінокислотних залишків Пептидна зв'язок - жорстка, ковалентна, генетично детермінована. та азотом носить характер частково подвійного зв'язку:
Навколо неї обертання неможливе і чотири атоми лежать у одній площині, тобто. компланарні. Обертання інших зв'язків навколо поліпептидного кістяка досить вільно.
Первинна структура відкрита у 1898 році професором казанського університету Данилевським. У 1913 Емілем Фішером були синтезовані перші пептиди.
Така послідовність амінокислот є унікальною для кожного білка та закріплена генетично. За порушення процесу синтезу первинної структури білка на рибосомі можуть розвиватися різні гететичні захворювання. Наприклад, при порушенні двох амінокислот у гемоглобіні розвивається серповидноклітинна анемія.
Для вивчення амінокислотного складу білків користуються поєднанням (або одним з них) кислотного (НСl), лужного (ОН)2) і рідше ферментативного гідролізу. Встановлено, що при гідроліз чистого білка, що не містить домішок, звільняється 20 різних а-амінокислот. Усі інші відкриті у тканинах тварин, рослин та мікроорганізмів амінокислоти (більше 300) існують у природі у вільному стані або у вигляді коротких пептидів чи комплексів з іншими органічними речовинами.
α-амінокислоти являють собою похідні карбонових кислот, у яких один водневий атом, у α -вуглецю, заміщений на аміногрупу (-NH2), наприклад: слід підкреслити, що всі амінокислоти, що входять до складу природних білків є а-амінокислотами, хоча аміногрупа в вільних амінікарбонових кислот може бути, як побачимо нижче, в β, γ, δ, ε -положениях.
9. Вторинна структура білків - α-спіралі та β-структури. Будова та функціональна роль доменів.
Вторинна структура - це просторове розташування поліпептидного ланцюжка у вигляді α-спіралі або β-складчастості безвідносно до типів бічних радикалів та їх конформації. Вона стабілізована водневими зв'язками, які замикаються між пептидними, амідними (-N-H) та карбонідними (-C=O) групами, тобто. входять в пептидну одиницю, і дисульфідними містками між залишками цистеїну
Полінг та Корі запропонували модель вторинної структури білка у вигляді лівозакрученої α-спіралі, в якій водневі зв'язки замикаються між кожною першою та четвертою амінокислотою, що дозволяє зберігати нативну структуру білка, здійснення простих функцій, захищати від руйнування. На один виток спіралі припадає 3,6 амінокислотних залишків, крок спіралі становить 0,54 нм. В утворенні водневих зв'язків беруть участь усі пептидні групи, що забезпечує максимальну стабільність, знижує гідрофільність та збільшує гідрофобність білкової молекули. Альфа-спіраль утворюється спонтанно і є найбільш стійкою конформацією, що відповідає мінімуму вільної енергії
Полінг та Корі запропонували й іншу впорядковану структуру – складчастий β-шар. На відміну від конденсованої α-спіралі β-шари майже повністю витягнуті і можуть розташовуватися як паралельно, так і антипаралельно
У стабілізації цих структур також беруть участь дисульфідні містки та водневі зв'язки.
Супервторинна структура – це більше високий рівеньорганізації білкової молекули, представлений ансамблем взаємодіючих між собою вторинних структур: α-спіраль - дві антипаралельні ділянки, взаємодіють гідрофобними комплементарними поверхнями (за принципом западина-виступ) αсα, надспіралізація α-спіралі, (βхβ)-елементи в глобулярних білках, β-ланцюгами, пов'язані сегментом х, βαβαβ-елементи, представлені двома сегментами α-спіралі, вставленими між трьома паралельними β-ланцюгами.
Для визначення амінокислот, що входять до складу білків, застосовують кислотний (НС1), лужний (ОН) 2) і ферментативний гідроліз. При гідроліз чистого білка, що не містить домішок, звільняються 20 різних амінокислот.
Амінокислоти,входять до складу білків, є
a-амінокислотами. Усі вони належать до L-ряду, а величина та знак оптичного обертання залежать від природи радикалів амінокислот та значення рН розчину. У білках людини D-амінокислоти не виявлені, проте вони зустрічаються у клітинній стінці бактерій, у складі деяких антибіотиків (актиноміцинів).
Амінокислоти відрізняються один від одного хімічною природою радикалу R, який не бере участі в утворенні пептидного зв'язку.
Сучасна раціональна класифікація амінокислот полягає в полярності радикалів:
Неполярні (гідрофобні)
 |  |
|
 |  |  |
Полярні (гідрофільні)
Негативно заряджені
У деяких білках виявлено похідні амінокислот. У білку сполучної тканини колагені містяться оксипролін та оксилизин. Дійодтірозін є основою структури гормонів щитовидної залози.
Амінокислоти мають загальною властивістю - амфотерністю(від грець amphoteros – двосторонній). В інтервалі рН 4,0-9,0 майже всі амінокислоти існують у формі біполяних іонів (цвіттеріонів). Значення ізоелектричної точки амінокислоти (ІЕТ, рI)розраховується за формулою:
.
Для моноамінодикарбонових кислот рI розраховується як напівсума значень рK (таблиця 1) a- та w-карбоксильних груп, для діаміномонокарбонових кислот – як напівсума значень рK a- та w-аміногруп.
Існують замінні амінокислоти (можуть синтезуватися в організмі людини) і незамінні, які в організмі не утворюються і повинні надходити з їжею.
Незамінні амінокислоти: валін, лейцин, ізолейцин, лізин, метіонін, треонін, триптофан, фенілаланін.
Замінні амінокислоти:гліцин, аланін, аспарагін, аспартат, глутамін, глутамат, пролін, серин.
Умовно замінні(Можуть синтезуватися в організмі з інших амінокислот): аргінін (з цитруліну), тирозин (з фенілаланіну), цистеїн (з серину), гістидин (за участю глутаміну).
Для відкриття в біологічних об'єктах та кількісного визначення амінокислот використовують реакцію з нінгідрином.
Таблиця 1. Константи дисоціації амінокислот
| Амінокислота | pK 1 | pK 2 | pK 3 |
| Аланії | 2,34 | 9,69 | |
| Аргінін | 2,18 | 9,09 | 13,2 |
| Аспарагін | 2,02 | 8,80 | |
| Аспарагінова кислота | 1,88 | 3,65 | 9,60 |
| Валії | 2,32 | 9,62 | |
| Гістідін | 1,78 | 5,97 | 8,97 |
| Гліцин | 2,34 | 9,60 | |
| Глутамін | 2,17 | 9,13 | |
| Глутамінова кислота | 2,19 | 4,25 | 9,67 |
| Ізолейцин | 2,26 | 9,62 | |
| Лейцин | 2,36 | 9,60 | |
| Лізін | 2,20 | 8,90 | 10,28 |
| Метіонін | 2,28 | 9,21 | |
| Пролін | 1,99 | 10,60 | |
| Серії | 2,21 | 9,15 | |
| Тирозін | 2,20 | 9,11 | 10,07 |
| Треонін | 2,15 | 9,12 | |
| Триптофан | 2,38 | 9,39 | |
| Фенілаланін | 1,83 | 9,13 | |
| Цистеїн | 1,71 | 8,33 | 10,78 |
Насамперед шляхом гідролізу руйнують пептидні зв'язки. Оскільки при нейтральних pH пептидні зв'язки стабільні, застосовують кислотний або лужний каталіз. Ферментативний каталіз для повного гідролізу є менш придатним. Повний гідроліз білка на амінокислоти складові неминуче супроводжується частковою втратою деяких амінокислотних залишків. Найкраще проводити
Мал. 4.7. Гель-фільтрація бромціанових (СВ) фрагментів фетального глобіну людини. Хроматографія проведена на колонці сефадекс врівноваженим НСООН, з подальшою елюцією тим же розчином. Нумерація фрагментів а-і у-ланцюгів довільна. (З люб'язного дозволу J. D. Pearson et al., Department of Biochemistry, Purdue University.)
гідроліз у 6 н. при 110°C у вакуумованій ампулі. У цих умовах повністю руйнуються триптофан до цистеїну та частково цистин. У присутності металів спостерігається часткова втрата метіоніну та тирозину. Глутамін та аспарагін кількісно дезамідуються в глутамат та аспартат. Вміст серину і треоніну теж виявляється заниженим, причому тим більше, чим довше проводиться гідроліз. Нарешті, деякі сязі між нейтральними залишками навіть через 20 год гідролізуються лише 50%. Зазвичай паралельні проби гідролізують протягом 24, 48, 72 і 96 год. Потім дані серину і треоніну наносять на графік в напівлогарифмічному масштабі і проводять екстраполяцію до нульового моменту часу. За валіном та ізолейцином використовують результати, отримані при 96-годинному гідролізі. Дикарбонові кислоти та їх аміди визначаються сумарно та реєструються як “Glx” або “Asx”. Цистеїн і цистин до гідролізу перетворюють на кислотостабільні похідні (наприклад, цистеїнову кислоту).
Мал. 4.8. Рідина хроматографія з оберненою фазою при високому тиску: профіль елюювання бромціанових (СВ) фрагментів фетального глобіну людини. Нумерація фрагментів а-і у-ланцюгів довільна. (З люб'язного дозволу J. D. Pearson et al. Department of Biochemistry, Purdue University.)
Для аналізу триптофану проводять лужний гідроліз; при цьому відбуваються руйнування серину, треоніну, аргініну та цистеїну та рацемізація всіх амінокислот. По закінченні гідролізу амінокислотний склад можна визначити за допомогою автоматичної хроматографії іонообмінної (див. рис. 3.12) або рідинної хроматографії під тиском.
Можна виділити такі етапи з'ясування первинної структури білків та пептидів:
1. Виділення білка в чистому вигляді та визначення його молекулярної маси
2. Визначення амінокислотного складу
3. Визначення N-кінцевої амінокислоти
4. Визначення С-кінцевої амінокислоти
5. Визначення амінокислотної послідовності
Виділення білка у чистому вигляді.Як правило, вихідний матеріалмістить багато різних білків. У зв'язку з цим виникає проблема виділення з цієї суміші білка, що цікавить, в чистому вигляді. При очищенні білків використовуються методи, що ґрунтуються на різниці:
1. Поверхневого заряду білків
2. Молекулярного розміру білків (що залежить від їхньої молекулярної маси)
3. Біологічна активність внаслідок зв'язування з субстратами або інгібіторами
Поділ білків за різницею величини поверхневого заряду.Сумарний поверхневий електричний заряд білка при цьому рН може бути негативним, нейтральним або позитивним. Для поділу білків з різним зарядом, подібно до того, як це було у випадку амінокислот, може бути використаний метод іонообмінної хроматографії (див. вище). Концентрацію білка в пробірках з елюатом визначають за допомогою спектрофотометра за інтенсивністю поглинання ультрафіолетового світла і будують графічну залежність її від об'єму рідини, що витекла з хроматографічної колонки.
Поділ білків за молекулярною масою. Якщо уявити молекули білків у вигляді кульок різної величини, розмір яких залежить від їхньої молекулярної маси, то виявиться, що у великих кульок буде більшою молекулярна маса або розмір молекул. Це означає, що білки можна розділити подібно до частинок в ситі - молекулярному ситі, утвореному гелем. Такий спосіб часто називають гель-фільтрацією або хроматографією виключення розміром. Нижче наводиться ілюстрація того, як за допомогою гель-фільтрації вдається поділити суміш білків різного розміру (рис.1.12).
Хроматографічну колонку заповнюють набряклим гелем. Частинки гелю приготовлені із пов'язаного поперечними зшивками полісахаридного матеріалу та містять велика кількістьмікропор. Розмір мікропор підбирають таким чином, щоб у них проникали менші з молекул, що розділяються, в той час як великі цього зробити не могли. Суміш білків, що розділяються, наносять на верхню частину колонки і елююють буферним розчином. Великі молекули, що захоплюються струмом низхідної рідини, не маючи можливості проникнути в пори гелевих частинок, будуть рухатися швидше. Найменші молекули проникають у пори і затримуються там. Якщо збирати витікає з колонки розчин рівними порціями в пробірки, то виявиться, що в більш ранніх порціях рідини, що витікає, будуть міститися білки великих розмірів, а в пізніших - менших розмірів. Шляхом підбору розміру пір можна домогтися поділу різних сумішей білків.
Рис.1.12. Схематичне зображення поділу білків методом гель-фільтрації
Якщо врахувати, що розмір молекули залежить від молекулярної маси, виявляється, що розділяючи білки методом гель-фільтрації, одночасно можна встановити його молекулярну масу.
Рис.1.13. Графік залежності молекулярної маси білків від обсягу виходу їх із хроматографічної колонки в ході гель-фільтрації
Обсяг елюату, що витікає з колонки, обернено пропорційний логарифму молекулярної маси білка. Таким чином, достатньо знати обсяг рідини, в якому вийшов з колонки білок, що цікавить, щоб, користуючись подібним графіком, можна було встановити його молекулярну масу (рис.1.13).
Ще одним методом, який дозволяє розділити білки залежно від їхньої молекулярної маси, є гель-електрофорез(див. вище).
Ультрацентрифугування.Якщо струсити посудину, заповнену піском з водою, а потім поставити її на рівну поверхню, то пісок швидко осяде на дно завдяки силі земного тяжіння. З високомолекулярними речовинами, що у розчині, цього станеться, оскільки теплове (броунівський) рух зберігає їх рівномірне розподіл у розчині. Осідання макромолекул, подібно до піщинок, відбудеться, тільки якщо їх піддати значному прискоренню.
