Ідентифікація лікарських засобів шляхом ближньої інфрачервоної спектроскопії. Бік-спектроскопія Бік спектрометрія

ЗООТЕХНІЯ І ВЕТЕРИНАРІЯ

УДК 636.087.72:546.6.018.42 ЗАСТОСУВАННЯ БІК-СПЕКТРОСКОПІЇ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ КІЛЬКОСТІ НЕОРГАНІЧНИХ І ОРГАНІЧНИХ СПОЛУКІВ У КОРМАХ

С.І. Миколаїв, доктор сільськогосподарських наук І.О. Кулаго, кандидат хімічних наук С.М. Родіонів, кандидат сільськогосподарських наук

Волгоградський державний аграрний університет

У цій роботі розглядаються можливості експрес методу БІК-спектроскопії визначення кількості вмісту в кормах неорганічних і органічних сполук. В результаті проведених досліджень було проведено перевірку працездатності збудованих градуювань на модельній суміші «зерно – бішофіт» для кількісної оцінки мінерального складу біологічних зразків. Результати показують, що ці градуювання можна використовувати для оцінки мінерального складу кормових сумішей.

Ключові слова: БІК-метод, градуювальна модель, бішофіт.

БІК-метод заснований на вимірі спектрів відображення або пропускання зразків у спектральному інтервалі прояву складових частот та обертонів фундаментальних частот коливань молекул води, білка, жиру, клітковини, крохмалю та інших важливих компонентів досліджуваних проб з подальшим розрахунком величини показника за вбудованою в аналізатор градуювальної моделі. Спектральна БІК-область охоплює діапазон довжин хвиль 750-2500 нм (0,75-2,5 мкм) або діапазон хвильових чисел 14000-4000 см-1. Випромінювання в цій спектральній області має велику проникаючу здатність і одночасно абсолютно безпечне для біологічних об'єктів. Завдяки цьому можна аналізувати цільне зерно різних культур без будь-яких збитків для зразка. Головними перевагами БІК-аналізаторів є: експресність вимірювань, відсутність пробопідготовки та реактивів. Сам процес аналізу займає 2-3 хвилини.

Одним із нових напрямків застосування БІК-методу у вивченні біологічних об'єктів є дослідження складу водних розчинів.

З літературних даних відомо, що сольові розчини безпосередньо неактивні в БІК-області та реєстрація сигналу спирається на зміну водневих зв'язків солями.

Типовим прикладом виміру за допомогою спектроскопії ближньої ІЧ-області «неспектральних властивостей» речовини є визначення сольового складу морської води. У зв'язку з цим значним стає поняття ІЧ-зсувного агента. Хлористий натрій змінює структуру води, модифікуючи водневі зв'язки, що відбивається на спектрах ближньої ІЧ-області .

У наукових розробках останніх роківважливе місце приділено вивченню дій різних макро- та мікроелементів у мінеральних добавках на обмінні процеси організму тварин та птиці та впливу цих добавок на якісні та кількісні показники виробленої продукції.

Як вказує Ва11оі'^ дефіцит кормів по амінокислотах та енергії

зазвичай веде тільки до зниження приріст і погіршення оплати корму, в той час

як дефіцит у мінеральних речовинах і вітамінах може спричиняти різні хвороби і навіть відмінки сільськогосподарських тварин.

Основне джерело отримання мінеральних речовин сільськогосподарськими тваринами – рослинні корми (за деяким винятком), які вводять до раціону як мінеральні добавки (сіль-лизунець – для тварин, крейда, черепашка – для птиці тощо). Мінеральний склад кормів коливається в залежності від їх якості, умов зростання рослин, рівня їх агротехніки та ряду інших факторів, включаючи так звану приналежність до біогеохімічної провінції.

Так як елементи мінерального харчування тварини отримують з кормом і частково з водою, у цій роботі були проведені дослідження водних розчинів солей (хлориду натрію та хлориду магнію) та деяких органічних сполук (цукор, амінокислота) із застосуванням сучасних спектральних методів із реєстрацією сигналів у БІК ( ближня ІЧ) – області.

Для вимірювання концентрацій водних розчинів бішофіту із застосуванням БІК-методу була побудована градуювальна модель:

1) вимірювання проводили у 4 точках (положення кювети);

2) кожна точка сканувалася двадцять чотири рази;

3) вимірювання починали з найнижчої концентрації бішофіту (1%);

4) кожен зразок вимірювався три рази, перші двічі при однаковому заповненні кювети, третій раз кювета заповнювалася наново;

5) зразки були підібрані таким чином, щоб охарактеризувати три області концентрацій.

В результаті була отримана модель градуювання для визначення концентрації бішофіту у воді з коефіцієнтом кореляції 0,99 (рисунок 1).

SEC J SECV I SEV] MD | Зразки з поганим хімічним аналізом Рахунки | Спектр, навантаження Хім. навантаження | Всього спектрів: 99

Передбачене значення

;-Н" рк-РП. в.

Референтне значення

Контроль викидів Критерій: 12"00001

Виключити виділені спектри

Скасувати всі зміни

Показник SEC R2sec

Кількість 0.432567 0.999078

Пряна тренда у = 0.0175+0.9991 х

Малюнок 1 - Градуювальна модель бішофіту

На малюнку 1 зображено градуювальну модель бішофіту побудовану на основі розчинів бішофіту з концентраціями від 1% до 10%, від 18% до 28%, від 32% до 42%.

Градуювальна модель Кількісний

SEC SECV | SEV J MD | Зразки з поганим хімічним Всього спектрів: 48

аналізом) Рахунки | Спектр, навантаження Хім. і

Передбачене значення

I. . 0 5 . . , . . . . 1 . . . . , . 10 15 20

Референтне значення

Показник:

|Кількість

Відображати дані у вигляді: | Графік

Контроль викидів

Критерій: I 2-0000< *SECV Обновить |

Виключити виділені спектри

Скасувати всі зміни

Показник SECV R2secv F Пряма тренда

Кількість 0.092000 0.999799 72877.753658 у = -0.0027+ 0.9996 X

Малюнок 2 - Градуювальна модель хлориду натрію

У такій же послідовності для порівняльної оцінкибула побудована градуювальна модель для натрію хлориду. Коефіцієнт кореляції моделі одержали 0,99.

На малюнку 2 зображено градуювальну модель розчину хлориду натрію з концентраціями від 1% до 10%, від 18% до 20%.

Для визначення концентрації цукру розчиненого в дистильованій воді вище викладеної послідовності була побудована градуювальна модель. Коефіцієнт кореляції моделі одержали 0,99 (рисунок 3).

Градуювальна модель Кількість

БІС 5ЕС\/ | БЕУ) МО | Зразки з поганим хімічним аі Всього спектрів: 107

м | Рахунки ] Спектр, навантаження | Хім. навантаження

Передбачене значення 60-

Референтне значення

Кількість

Відображати дані у вигляді: | Графік

Контроль викидів

Критерій: | 2-0000(“БЕСУ Оновити |

Виключити виділені спектри

Скасувати всі зміни

Показник БЕСУ (геєес/Р Пряма тренда

Кількість 0.218130 0.999851 230092.131072 у =0.0114 + 0.9996 х

Малюнок 3 - Градуювальна модель цукру

На малюнку 3 зображено градуювальну модель розчину цукру з концентраціями від 1% до 10%, від 18% до 28%, від 40% до 45%.

Градуювальна модель Якісна

Малюнок 4 - Розподіл градуювальних моделей: 1) Р-аланіну, 2) цукру,

3) бішофіту, 4) хлориду натрію в єдиній системі координат Для оцінки одержаних моделей у координатах двох головних компонентів провели якісне порівняння точок розподілу градуювальних моделей: 1) Р-аланіну, 2) цукру, 3) бішофіту, 4) хлориду натрію.

З використанням даних градуювань було проведено такі дослідження. Були приготовлені розчини бішофіту з масовою часткою розчиненої речовини 2%, 4%, 10%, яким змочували зерно (пшениці, ячменю, вівса). При вимірюванні концентрації розчину бішофіту з використанням БІК-методу, яким змочували зерно (пшениці, ячменю, вівса), були отримані такі дані (таблиця 1).

Таблиця 1 - Концентрація бішофіту

Концентрація розчину бішофіту до змочування зерна (пшениці, ячменю, вівса) Концентрація розчину бішофіту після змочування зерна (пшениці, ячменю, вівса)

пшениця ячмінь овес

10 % 10,1 10,2 10,3

При змочуванні зерна (пшениці, ячменю, вівса) розчином бішофіту з різними концентраціями (2%, 4%, 10%) колір розчину бішофіту змінювався.

У кожному випадку розчин бішофіту, яким змочували зерно, фарбувався, можливо, органікою (пігментами) зерна, причому візуально розчин мав більш насичений колір при концентраціях бішофіту 2%, при підвищенні концентрації розчину бішофіту інтенсивність забарвлення розчину, яким змочували зерно, зменшувалася.

З аналізу результатів таблиці 1 видно, що концентрація розчину бішофіту (2%, 4%, 10%), яким змочували зерно (пшениці, ячменю, вівса) практично не змінилася. Зерно поглинало деякий об'єм рідини. Після цього невикористаний розчин зливали та заміряли його об'єм. Можна припустити, що на зерні (пшениці, ячменю, вівса) залишилася та кількість солі, яка була розчинена у витраченому обсязі бішофіту.

Розрахунки показали, що при змочуванні зерна пшениці масою 1000 г розчином бішофіту з концентраціями (2%, 4%, 10%) на зерні (пшениці, ячменю, вівса) має залишитися кількість магнію та хлору, зазначена в таблиці 2.

Таблиця 2 - Розрахунковий вміст катіонів магнію та аніонів хлору на зерні _______(пшениці, ячменю, вівса), після обробки розчином бішофіту_______

Кількість магнію г, що залишається на зерні масою 1000 г при змочуванні бішофітом Кількість хлору г, що залишається на зерні масою 1000 г при змочуванні бішофітом

2 % 4 % 10 % 2 % 4 % 10 %

Зерно пшениці 2,4 5,0 11,2 7,1 14,8 33,2

Зерно ячменю 2,0 4,2 10,6 6,1 12,6 31,6

Зерно вівса 4,8 9,8 21,2 14,2 29,2 62,8

Для визначення кількості катіонів магнію та аніонів хлору зерна (пшениці, ячменю, вівса) обробленого розчином бішофіту (2%, 4%, 10%), був використаний метод капілярного електрофорезу (КЕФ). Дослідження проводилися на аналізаторі Капель 105, використовувалися методика визначення катіонів в кормах М 04-65-2010 розробник (ТОВ ЛЮМЕКС), методика визначення аніонів в кормах М 04-73-2011 розробник (ТОВ ЛЮМЕКС). Досліджувалося зерно (пшениці, ячменю, вівса) змочене розчином бішофіту (2%, 4%, 10%). Результати досліджень відображені у таблиці 3.

Таблиця 3 - Зміст катіонів та аніонів у зерні (пшениці, ячменю, вівса).

Кількість магнію, г Кількість хлору, г

у 1000 г зерна у 1000 г зерна

Без бішофіта Бішофіт 2 % о4 4 т і & о ш і Б Бішофіт 10 % Без бішофіта о4 2 т і & о ш і Б о4 4 т і & о ш і Б Бішофіт 10 %

Зерно пшениці 2,8 4,5 6,7 11,4 3,3 8,5 12,G 22,7

Зерно ячменю 2,4 3,9 5,6 16,G 4,5 5,6 1G,4 26,G

Зерно вівса 2,3 6,2 11,6 36,G 4,1 1G,G 26,G 44,G

1. Традиційно звичним в оцінці якості води та кормів вважається наявність кількості того чи іншого мінералу у воді та кормах, у даному випадку ми стикалися з якістю впливу мінералу на фізико-хімічні властивості води та можливо на кормову суміш.

2. Порівняння двох градуювальних моделей (розчинів хлориду натрію та хлориду магнію) показало, що градуювальна модель хлориду натрію спирається на спектральний діапазон від 10400 до 10900 см-1, а для бішофіту (хлориду магнію) від 10100 до 10100 до 1. З літературних даних відомо, що сольові розчини безпосередньо неактивні в БІК-області та реєстрація сигналу спирається на зміну водневих зв'язків солями.

Отже, вплив натрію хлориду на водневі зв'язки в системі сіль-вода відрізняється від впливу хлориду магнію на водневі зв'язки в тій же системі.

3. У єдиній системі координат, органічні та неорганічні компоненти розподілялися у певній послідовності, не перемішуючись.

4. Розрахована кількість магнію, яка мала залишитися на зерні (пшениці, ячменю, вівса), практично повністю збігається з фактичною кількістю магнію, визначеною з використанням системи капілярного електрофорезу Капель-105.

Кількість хлору значно менша за розрахований.

5. Аналіз таблиці 3 показує, що дані, отримані за допомогою градуювань БІК-методу, підтверджуються дослідженнями КЕФ.

6. В результаті проведених досліджень було проведено перевірку працездатності побудованих градуювань на модельній суміші «зерно – бішофіт» для кількісної оцінки мінерального складу біологічних зразків. Результати показують, що ці градуювання можна використовувати для оцінки мінерального складу кормових сумішей.

бібліографічний список

1. Георгіївський, В.І. Вплив рівня магнію в раціоні на зростання та розвиток курчат-бройлерів [Текст]/В.І. Георгіївський, А.К. Османян, І. Ціцькієв // Хімія в сільському господарстві. – 1973. – № 10. – С. 68-71.

2. Шептун, В.Л. Введення в метод спектроскопії у ближній інфрачервоній галузі [Текст]: методичний посібник/В.Л. Шептун. – Київ: Центр методів інфрачервоної спектроскопії ТОВ «Аналіт-Стандарт», 2005. – 85 с.

3. Шмідт, В. Оптична спектроскопія для хіміків та біологів [Текст] / Ст. Шмідт. -М.: Техносфера, 2007. – 368 с.

Переваги спектроскопії БІК

Простота проведення вимірів
Висока точність та відтворюваність аналізу (точність аналізу визначається якістю обробки спектру, люфтами та точністю калібрування механічних частин, калібруванням джерела випромінювання)
Немає забруднень
Можливість проведення вимірювань через скляну та пластикову упаковку
Автоматизація вимірів. Використовується програма OPUS. Робота з даною програмою вимагає високої кваліфікації користувача
Перенесення методу з одного приладу на інший
Аналіз фізичних та хімічних властивостей

Переваги раманівської спектроскопії

Не потрібно попередньої підготовки зразка
Внаслідок відсутності механічних частин та більш певних спектральних характеристик, вимірювання раманівських спектрів значно простіше ніж БІК
Вимірювання методом раманівської спектроскопії розглядається як відбитки пальців хімічних речовин(Тобто найточніше з існуючих на сьогоднішній день). Відсутність рухомих частин та незалежність романівського спектру від флуктуацій частоти та інтенсивності випромінювача забезпечують надвисоку повторюваність вимірів.
Немає забруднень
Існує можливість проведення вимірювань через скляну (у тому числі з кольорового скла) та пластикову упаковку, причому ідентифікація окремих елементів (упаковки та ліків) суттєво надійніша ніж у методі БІК
Автоматизація вимірів. Створено програмний інтерфейс користувача, що дозволяє оперувати приладом непідготовленому користувачеві. Програма легко адаптується до кінцевого користувача. Цей пункт дуже важливий для роботи фармацевтів та медиків
Спектри романівського розсіювання, зняті на двох різних приладах з однаковим спектральним дозволом, завжди збігаються. Тому проблеми перенесення методу не існує
Можливий точніший аналіз фізичних і хімічних властивостей досліджуваних речовин, оскільки у методиці БІК вимірюються обертони фундаментальних коливань, пряме отримання фізичної інформації з енергії та перерізу розсіювання яких дуже важко, якщо неможливо. У раманівській спектроскопії проводиться аналіз самих фундаментальних коливань молекул хімічних речовин, повна інформаціяпро які або вже доступна, або може бути отримана простими експериментальними та теоретичними методами

Характеристики приладів

БІК

Швидкість (зазвичай 5 – 10с)
Компактні розміри
Роздільна здатність, що визначається шириною досліджуваних ліній (близько 100 см-1)
Мінімальна кількість речовини для аналізу приблизно 0.1 мг
Немає бази даних. Метод з'явився нещодавно та каліброваних спектрів БІК надзвичайно мало. Це означає, що має бути проведена величезна робота (виконана кваліфікованим персоналом) щодо створення відповідної бази даних лікарських препаратів

Інспектор

Швидкість (зазвичай менше 1 с)
Портативний романівський комплекс ІнСпектр має суттєво менші розміри і вага ніж БІК спектрометр
Роздільна здатність, що визначається шириною досліджуваних ліній (близько 6 см-1). Це означає, що можна ідентифікувати значно більшу кількість речовин
Мінімальна кількість речовини для аналізу приблизно 0.001 мг (тобто у 100 разів менше). Це пов'язано з кращою чутливістю приймальної системи у видимому діапазоні
Метод добре опрацьований. Накопичено базу даних каліброваних спектрів великої кількостілікарських препаратів та хімічних речовин

на правах рукопису

ДОВБНЄВ ДМИТРИЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ

ІДЕНТИФІКАЦІЯ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ МЕТОДОМ БЛИЖНЬОЇ ІНФРАКРАСНОЇ СПЕКТРОСКОПІЇ

14.04.02 – фармацевтична хімія, фармакогнозія

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Москва – 2010

Робота виконана у ГОУ ВПО Перший Московський державний медичний університет імені

Наукові керівники:

доктор фармацевтичних наук, академік РАМН, професор

доктор фармацевтичних наук, професор

Офіційні опоненти:

Провідна організація:

Всеросійський науковий центр безпеки біологічно активних речовин (ВНЦ БАВ)

Захист відбудеться «___»____________________2010 р. о ____ годині на засіданні Дисертаційної ради (Д 208.040.09) при Першому Московському державному медичному університеті імені Москва, Нікітський бульвар, 13.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці МДМУ ім. Москва, Нахімовський проспект, 49.

Вчений секретар дисертаційного

поради Д 208.040.09

доктор фармацевтичних наук,

професор

Актуальність теми дослідження. В останні 15 років метод ближньої інфрачервоної (БІК) спектроскопії бурхливо розвивається і знайшов застосування у найрізноманітніших галузях. БІК-спектроскопія відома як ефективний методякісного та кількісного аналізу. Цей метод широко застосовується в сільському господарстві (для визначення якості ґрунтів, вмісту білка, жиру та ін. харчових продуктах), у промисловості (для визначення складу нафтопродуктів, якості текстильних продуктів і т. д.), у медицині (для визначення жиру, кисню в крові, дослідження розвитку пухлин). В даний час БІК-спектроскопія стає одним із методів внутрішньовиробничого контролю у фармацевтичній промисловості в Європі та США.

Вона використовується для перевірки вхідної сировини, однорідності змішування, визначення кінцевої точки грануляції, вмісту вологи при сушінні, однорідності таблетування, вимірювання товщини покриттів.

Метод БІК-спектроскопії описаний у Європейській фармакопеї та Фармакопеї США, однак у фармакопейному аналізі використовується поки що відносно рідко: переважно при визначенні вмісту води у препаратах, отриманих із крові.

У зв'язку з цим велике значення має розробка уніфікованих методик аналізу фармацевтичних субстанцій та лікарських препаратів для їх подальшого використання у фармакопейному аналізі.

Особливої ваги це питання набуває у зв'язку з виходом 12 видання Державної фармакопеї РФ.

Необхідно також відзначити проблему фальсифікованих, що зберігається. лікарських засобів, Одним із шляхів вирішення якої є розробка експрес-методів аналізу.

Враховуючи вищесказане, актуальною проблемою є розробка уніфікованих методів аналізу субстанцій та препаратів та виявлення фальсифікованих лікарських засобів із використанням методу БІК-спектроскопії.

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження стала розробка уніфікованих методів аналізу субстанцій та препаратів та виявлення фальсифікованих лікарських засобів з використанням методу БІК-спектроскопії.

Досягнення поставленої мети вирішували такі:

– вивчити можливість отримання БІК-спектрів субстанцій, таблеток та капсул з використанням оптоволоконного датчика та інтегруючої сфери;

– провести порівняння БІК-спектрів субстанцій та препаратів;

– провести порівняння БІК-спектрів препаратів із різним вмістом діючої речовини;

– вивчити можливість використання БІК-спектроскопії для встановлення справжності субстанцій та препаратів конкретних виробників, а також виявлення фальсифікованих лікарських засобів;

– розробити електронну бібліотеку БІК-спектрів субстанцій та препаратів.

Наукова новизна результатів дослідження. Вперше показано, що метод БІК-спектроскопії можна використовувати як для встановлення автентичності фармацевтичних субстанцій, так і для готових лікарських препаратів (таблетки та капсули). Показано, що у загальному випадку БІК-спектри субстанцій та препаратів різняться. Спектри можна отримувати з використанням оптоволоконного датчика та інтегруючої сфери. Показано, що якщо оболонка капсули або упаковка таблеток (блістер) прозорі, отримувати спектр можна без вилучення капсул або вилучення таблеток із упаковки. Показано, що метод БІК-спектроскопії можна використовувати для виявлення фальсифікованих лікарських засобів за умови порівняння спектрів оригінального та випробуваного препаратів. Спектри субстанцій та препаратів можна зберігати у вигляді електронної бібліотеки. Встановлено, що для більш надійного порівняння спектра випробуваного препарату та стандартного спектра потрібне використання математичного відпрацювання даних.

Практична значущість роботи. Розроблені методики аналізу лікарських засобів з використанням методу БІК-спектроскопії пропонуються для встановлення автентичності фармацевтичних субстанцій, препаратів у формі таблеток та капсул. Методики дозволяють використовувати інтегруючу сферу та оптоволоконний датчик («пістолет»).

Розроблені методики також можуть застосовуватися для експрес-ідентифікації фальсифікованих лікарських засобів та для вхідного та вихідного контролю фармацевтичних субстанцій та напівпродуктів на фармацевтичних підприємствах. Методики дозволяють часом проводити неруйнівний контроль якості без розкриття первинної упаковки.

Розроблена бібліотека БІК-спектрів може бути використана при ідентифікації субстанцій, таблеток та капсул з використанням оптоволоконного датчика (пістолета) та інтегруючої сфери.

Результати роботи апробовані та використовуються у відділі контролю якості.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідені та обговорені на XII Російському національному конгресі «Людина і ліки» (Москва, 2005 р.), Міжнародному конгресі з аналітичної хімії ICAS (Москва, 2006 р.) та XIV Російському національному конгресі , 2007 р.). Апробацію роботи проведено на науково-практичному засіданні кафедри фармацевтичної хімії з курсом токсикологічної хімії фармацевтичного факультету МДМУ ім. 22 березня 2010 р.

Публікації. На тему дисертації опубліковано 5 друкованих праць.

Зв'язок досліджень із проблемним планом фармацевтичних наук. Дисертаційну роботу виконано в рамках комплексної теми кафедри фармацевтичної хімії МДМУ ім. «Удосконалення контролю якості лікарських засобів (фармацевтичні та екологічні аспекти)» (держ. реєстр. № 01.200.110.54.5).

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 110 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, 5 розділів експериментальних досліджень, загальних висновків, списку літератури, а також окремо включає 1 додаток. Дисертаційна робота ілюстрована 3 таблицями та 54 малюнками. Список літератури включає 153 джерела, з них – 42 іноземні.

Положення, що виносяться на захист:

– результати вивчення можливості отримання БІК-спектрів субстанцій, таблеток та капсул з використанням оптоволоконного датчика та інтегруючої сфери;

– результати порівняльного дослідження БІК-спектрів субстанцій та препаратів, а також БІК-спектрів препаратів з різним вмістом діючої речовини;

– результати вивчення можливості використання БІК-спектроскопії для встановлення справжності субстанцій та препаратів конкретних виробників, а також виявлення фальсифікованих лікарських засобів.

1. Об'єкти дослідження

Досліджено субстанції та препарати низки лікарських засобів. Загалом у дослідженні використано 35 субстанцій: алюмінію гідроксид, амікацину сульфат, аскорбінова кислота, аскорбат натрію, варфарин натрію, вітамін В12, гемфіброзил, гідроксид магнію, глюренорм, Д-біотин, заліза глюконат, зопіклон, кальцію Д пантеноат, кліндаміцину фосфат, лідокаїну гідрохлорид, метопрололу тартрат, , ранитидину гідрохлорид , рибофлавін, тіаміну мононітрат, тиротрицин, фамотидин, фолієва кислота, цефадроксил, цефазоліну натрієву сіль, цефтизоксиму натрієву сіль, ципрофлоксацину гідрохлорид, ціанкобламін, різних виробників та 59 препаратів різних виробників, що містять: ізоніазид, мелоксикам, омепразол, ранітидину гідрохлорид, рифампіцин, а також 2 фальсифіковані зразки (ОМЕЗ 20 мг, Dr. Reddy`s Lab. та ріфампіцин 150 мг,).

2. Обладнання та умови випробувань

У роботі використовували прилад МРА – Фур'є-спектрометр ближнього ІЧ-діапазону (Bruker Optics GmbH, Німеччина). Параметри запису: спектральний діапазон від 800 до 2500 нм (відсм-1 до 4000 см-1), кількість сканів 16, спектральна роздільна здатність 4 см-1. Управління приладом та обробку отриманих спектрів проводили з використанням пакету програм OPUS 6.0 (Bruker Optics GmbH, Німеччина). БІК-спектри отримували двома способами:

1) за допомогою оптоволоконного датчика («пістолет»),

Обидва способи використовували для отримання БІК-спектрів субстанцій, таблеток та капсул.

Оптоволоконний датчик («пістолет») дозволяє проводити вимірювання лише на відображення, інтегруюча сфера – як на відображення, так і пропускання. У роботі отримували БІК-спектри відбиття.

2.1. Методики отримання БІК-спектрів:

за допомогою оптоволоконного датчика («пістолета»).

2.1.1. Субстанції . Субстанцію-порошок пересипали в прозору кювету, товщиною шару від 1 до 3 см. Потім оптоволоконний датчик притискали перпендикулярно поверхні порошку. Процедуру реєстрації спектра запускали натисканням кнопки на оптоволоконний датчик. Вимір спектрів повторювали 3 - 5 разів від різних ділянок для отримання статистично достовірних результатів аналізу.

2.1.2. Пігулки, витягнуті з блістера . Оптоволоконний датчик притискали перпендикулярно до таблетки. Процедуру реєстрації спектра запускали натисканням кнопки на оптоволоконний датчик. Вимір спектрів повторювали 3 - 5 разів від різних ділянок таблетки для отримання статистично достовірних результатів аналізу.

2.1.3. Таблетки у блістері . Якщо блістер прозорий, вимірювання проводили в такий спосіб, оптоволоконний датчик притискали перпендикулярно поверхні таблетки в блістері. Процедуру реєстрації спектра запускали натисканням кнопки на оптоволоконний датчик. Вимір спектрів повторювали 3 - 5 разів від різних ділянок таблетки в блістері для отримання статистично достовірних результатів аналізу. Якщо блістер непрозорий або алюмінієвий, спочатку вилучали таблетку з блістера, а потім отримували БІК-спектр.

2.1.4. Капсули . Якщо оболонка капсули прозора, вимірювання проводили наступним чином, оптоволоконний датчик притискали перпендикулярно поверхні капсули в блістері. Процедуру реєстрації спектра запускали натисканням кнопки на оптоволоконний датчик. Вимір спектрів повторювали 3 - 5 разів від різних ділянок капсули в блістері для отримання статистично достовірних результатів аналізу. Якщо оболонка капсули не прозора, спочатку розкривали капсулу, а потім вимірювали спектр вмісту в скляній кюветі.

2.2. Методики отримання БІК-спектрів:

за допомогою інтегруючої сфери.

Отримання БІК-спектрів у режимі відображення

2.2.1. Субстанції . Субстанцію-порошок пересипали в прозору кювету, товщиною шару від 1 до 3 см. Потім встановлювали зверху кювету оптичного вікна інтегруючої сфери. Процес вимірювання запускали на комп'ютері за допомогою програми OPUS або безпосередньо на приладі (кнопка Start). Вимір спектрів повторювали 3 - 5 разів для отримання статистично достовірних результатів аналізу.

2.2.2. Пігулки, витягнуті з блістера . Таблетку поміщали у спеціальний утримувач. Встановлювали тримач із таблеткою зверху оптичного вікна інтегруючої сфери. Процес вимірювання запускали на комп'ютері за допомогою програми OPUS або безпосередньо на приладі (кнопка Start). Вимір спектрів повторювали 3 - 5 разів від різних ділянок таблетки для отримання статистично достовірних результатів аналізу.

2.2.3. Капсули . Якщо оболонка капсули прозора, вимірювання проводили наступним чином, капсулу поміщали в спеціальний тримач. Встановлювали тримач із капсулою зверху оптичного вікна інтегруючої сфери. Процес вимірювання запускали на комп'ютері за допомогою програми OPUS або безпосередньо на приладі (кнопка Start). Вимір спектрів повторювали 3 - 5 разів від різних ділянок капсули для отримання статистично достовірних результатів аналізу. Якщо оболонка капсули не прозора, спочатку розкривали капсулу, а потім вимірювали спектр вмісту в скляній кюветі, поміщаючи кювету зверху оптичного вікна інтегруючої сфери.

3. Математична обробка БІК-спектрів.

Математичну обробку отриманих спектрів проводили з використанням програми «OPUS IDENT», що входить до пакету програм OPUS 6.0 (Bruker Optics GmbH, Німеччина). Невідомий спектр порівнювали із бібліотечним спектром порівняння шляхом розрахунку спектральної відстані. IDENT ідентифікує ті спектри порівняння, які є найближчими до аналізованого спектру, і визначає відхилення між цими спектрами та аналізованим спектром. Це дозволяє IDENT ідентифікувати невідомі речовини та оцінювати ступінь відповідності речовини стандарту порівняння.

Нами було використано два способи математичної обробки БІК-спектрів: 1) Ident-аналіз, який співвідносить спектр та конкретну речовину та 2) кластерний аналіз, який співвідносить спектр та групу речовин.

Як тільки спектри виміряно, генерується середній спектр кожного матеріалу та створюється бібліотека всіх таких середніх спектрів, куди вносяться і статистично визначені прийнятні критерії (або пороги) для всіх речовин у бібліотеці. Досліджуваний спектр порівнювали з усіма спектрами порівняння, що знаходяться в електронній бібліотеці. Результат порівняння між спектром А та В закінчується видачею спектральної відстані D, яка у програмі IDENT називається «коефіцієнтом якості збігу». Спектральна відстань показує ступінь спектральної подоби. Два спектри зі спектральною відстанню, що дорівнює нулю, повністю ідентичні. Чим більша відстань між двома спектрами, тим більша спектральна відстань. Якщо спектральна відстань менша, ніж поріг для однієї речовини, і більша, ніж поріг для всіх інших речовин, невідома речовина ідентифікована.

Кластерний аналіз дозволяє досліджувати БІК-спектри на кшталт і поділити подібні спектри на групи. Ці групи називають класами чи кластерами. Даний вид аналізу проводився для зручнішого представлення даних у графічній формі.

Ієрархічні кластерні алгоритми виконуються за такою схемою:

· Спочатку, розраховують спектральні відстані між усіма спектрами,

· потім два спектри з найвищою подобою зливають у кластер,

· обчислюють відстані між цим кластером та всіма іншими спектрами,

· два спектри з найменшою відстанню зливаються знову в новий кластер,

· Розраховують відстані між цим новим кластером та всіма іншими спектрами,

· Два спектри зливаються в новий кластер

Ця процедура повторюється до того часу, поки залишиться лише один великий кластер.

4 . Результати дослідження

Вивчено можливість використання методу БІК-спектроскопії для ідентифікації субстанцій та лікарських препаратів низки вітчизняних та зарубіжних виробників.

В результаті дослідження було створено шість різних електронних бібліотек БІК-спектрів:

1) БІК-спектри вмісту капсул, отримані з використанням оптоволоконного датчика («пістолета»),

2) БІК-спектри вмісту капсул, отримані з використанням інтегруючої сфери,

3) БІК-спектри таблеток, отримані з використанням оптоволоконного датчика («пістолета»),

4) БІК-спектри таблеток, отримані з використанням інтегруючої сфери,

5) БІК-спектри субстанцій, отримані з використанням оптоволоконного датчика («пістолета»),

6) БІК-спектри субстанцій, одержані з використанням інтегруючої сфери.

4.1. Залежність БІК-спектрів субстанцій та препаратів від способу одержання (за допомогою «пістолета» та інтегруючої сфери).

На рис. 1 представлені БІК-спектри субстанції ранитидину гідрохлориду Vera Laboratories (Індія), отримані з використанням пістолета та інтегруючої сфери. На малюнку видно, що діапазони різняться за інтенсивністю смуг поглинання, але самі лінії поглинання збігаються за значеннями хвильових чисел.

Основною відмінністю БІК-спектроскопії від ІЧ-спектроскопії середньої області є те, що спектри між собою не можна порівнювати візуально. Справа в тому, що загалом на БІК-спектрі спостерігається недостатня кількість смуг, а інтенсивність багатьох смуг низька (особливо других та третіх обертонів), тому потрібно проводити математичну обробку спектрів.

https://pandia.ru/text/78/375/images/image003_173.jpg" width="624" height="388">

Мал. 2. Результат IDENT аналізу БІК-спектру таблеток Ульфамід 40 мг, KRKA (Словенія), отриманого з використанням пістолета при використанні електронної бібліотеки БІК-спектрів, отриманої з використанням інтегруючої сфери.

Мал. 3. Результат IDENT аналізу БІК-спектру таблеток Ульфамід 40 мг, KRKA (Словенія), отриманого з використанням інтегруючої сфери при використанні електронної бібліотеки БІК-спектрів, отриманої з використанням пістолета.

4.2. Ідентифікація активної субстанції за БІК-спектром препаратів, що містять цю субстанцію.

https://pandia.ru/text/78/375/images/image008_152.gif" width="648" height="234"> .gif" width="648" height="244">.jpg" width="649" height="235 src=">

Мал. 7. Результат IDENT-аналізу БІК-спектру таблеток Ципрофлоксацин 250 мг, Cypress Pharmaceutical Inc. (США), при використанні бібліотеки, що складається з БІК-спектрів різних субстанцій.

Таким чином, нами було встановлено, що при високому вмісті діючої речовини (не менше 40%) у препараті можливе встановлення справжності препарату за БІК-спектром субстанції.

4.3. Ідентифікація препаратів з різним дозуванням за БІК-спектрами.

У третій частині дослідження було встановлено, що метод БІК-спектроскопії можна використовувати для визначення різних дозувань того чи іншого препарату, якщо вони є в електронній бібліотеці БІК-спектрів. Для цього з препаратів, що містять у своєму складі фамотидин як діюча речовина, була створена електронна бібліотекаБІК-спектрів, до якої увійшло 27 зразків від 7 різних виробників у дозуваннях 10 мг, 20 мг та 40 мг (рис. 8).

https://pandia.ru/text/78/375/images/image016_63.jpg" width="648" height="216 src=">

https://pandia.ru/text/78/375/images/image018_70.jpg" width="648" height="223 src=">

Мал. 9. Результати IDENT-аналізу, таблеток квамамг, 20 мг та 40 мг, Gedeon Richter Plc. (Угорщина) при використанні бібліотеки, що складається з БІК-спектрів різних препаратів у різних дозах.

4.4. Ідентифікація лікарських засобів через блістер.

Для встановлення можливості ідентифікації лікарських препаратів методом БІК-спектроскопії через блістер, додатково було створено дві бібліотеки БІК-спектрів №7 та №8:

7) БІК-спектри капсул, отримані з використанням оптоволоконного датчика («пістолета») безпосередньо через блістер,

8) БІК-спектри таблеток, отримані з використанням оптоволоконного датчика (пістолета) безпосередньо через блістер.

У процесі аналізу БІК-спектри препаратів, отримані через блістер, порівнювали з БІК-спектрами, одержаними з поверхні таблеток або капсул без блістеру. На рис. 10 представлено порівняння спектрів для капсул рифампіцину.

https://pandia.ru/text/78/375/images/image020_58.jpg" width="624" height="268 src=">

Мал. 11. Результат IDENT-аналізу БІК-спектру капсул рифампіцин 150 мг (Росія), отриманого з використанням пістолета безпосередньо через блістер при використанні електронної бібліотеки, отриманої через блістер.

https://pandia.ru/text/78/375/images/image013_124.gif" width="14" height="136">

Мал. 13 БІК-спектри вмісту капсул омепразолу 20 мг 14 різних виробників у порівнянні з фальсифікованим зразком, отримані з використанням інтегруючої сфери.

З даних видно, що без математичної обробки достовірно відрізнити можна лише спектр фальсифікату.

Використовуючи програмне забезпечення «OPUS IDENT» для тривимірної моделі статистичної обробки спектрів («кластерний аналіз») ми отримали розподіл БІК-спектрів дженериків капсул омепразол 20 мг, які можна представити у вигляді дендрограми (рис. 14).

Мал. 14. Кластерний аналіз досліджуваних зразків, знятих у триразовій повторності від 14 різних виробників.

В результаті проведеного кластерного аналізу всі препарати добре розділилися за своїми класами та відповідно до свого виробника (рис. 14).

Математична обробка одержаних результатів IDENT-аналізом показала наявність фальсифікованого лікарського засобу. Програма OPUS визначила, що даний зразок Х дійсно є фальсифікованим і його «коефіцієнт якості збігу» (спектральна відстань) є набагато вищим за поріг для всіх препаратів даної групи (омепразол, капсули 20 мг) 14 різних виробників, з яких була створена електронна бібліотека (мал. 15).

Мал. 15. Результат IDENT-аналізу для фальсифікованого зразка ОМЕЗ 20 мг, Dr. Reddy`s Lab. (Індія).

В результаті проведеного IDENT-аналізу серії всіх оригінальних зразків капсул омепразол 20 мг були унікально ідентифіковані, і нами була складена зведена таблиця результатів для всіх зразків, включаючи зразок фальсифікованих (табл. 1).

Табл. 1. Зведена таблиця результатів IDENT аналізу групи омепразол, капсули 20 мг.

Найменування зразка	Спектральна відстань
Фальсифікований зразок
Зразок фірми KRKA
Зразок фірми Акріхін
Зразок фірми Ranbaxy Laboratories
Приклад фірми Dr. Reddy`s Lab.
Приклад фірми M. J. Boipharm
Зразок фірми
Зразок фірми
Зразок фірми
Зразок фірми-Фарма»
Зразок фірми Оболенське»
Приклад фірми. віт. завод»

Таким чином, в результаті проведених досліджень з ідентифікації лікарських препаратів омепразолу різних виробників методом БІК-спектроскопії нам вдалося отримати результати виявлення контрафактної продукції для фальсифікованого препарату ОМЕЗ 20 мг, Dr. Reddy`s Lab. (Індія), а також унікально визначити кожен дженерик відповідно до свого виробника. Також нами були отримані позитивні результати IDENT-аналіз для всіх таблеток, що містять ранитидину гідрохлорид (12 зразків) і фамотидин (9 зразків) дозволяють унікально визначити виробника кожного зразка.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

1. Показано, що БІК-спектри субстанцій, таблеток та капсул можна отримувати з використанням оптоволоконного датчика та інтегруючої сфери. При цьому для встановлення справжності слід використовувати електронну бібліотеку, отриману тим же способом, що застосовується для зняття БІК-спектру випробуваного зразка.

2. Показано, що при високому вмісті (не менше 40%) діючої речовини препарату можливе встановлення справжності препарату за спектром субстанції. Однак, у загальному випадку для ідентифікації препаратів слід використовувати електронну бібліотеку, складену на основі БІК-спектрів відповідних препаратів.

3. Встановлено, що метод БІК-спектроскопії може бути використаний для диференціювання препаратів конкретного виробника, які містять одну діючу речовину у різних дозах. При цьому проводити кількісне визначення діючої речовини в препаратах різних виробників з використанням методу БІК-спектроскопії у ряді випадків важко.

4. Показано, що метод БІК-спектроскопії може бути використаний для ідентифікації виробника субстанції або препарату. При цьому слід проводити паралельний аналіз випробуваного засобу конкретної серії та відомого засобу тієї ж серії.

5. Розроблено електронну бібліотеку БІК-спектрів субстанцій та препаратів, що містять різні діючі речовинита виготовлені різними виробниками.

1. , Порівняльна оцінка якості препаратів методом ближньої інфрачервоної спектроскопії // Тез. доп. XII Російський нац. конгр. «Людина та ліки». - М., 18-22 квіт. 2005. - С. 780.

2. , Виявлення фальсифікованих лікарських засобів методом БІК-спектроскопії// Тез. доп. XIV Російський нац. конгр. «Людина та ліки». - М., 16-20 квіт. 2007. - С. 17.

3. , Метод ближньої інфрачервоної спектроскопії як перспективний напрямок в оцінці якості лікарських засобів // Питання біологічної, медичної та фармацевтичної хімії. – 2008. – №4. – С. 7-9.

4. , Застосування методу ближньої інфрачервоної спектроскопії для ідентифікації лікарських засобів // Питання біологічної, медичної та фармацевтичної хімії. – 2008. – №6. – С. 27-30.

5. Arzamastsev A. P., Dorofeyev V. L., Dolbnev D. V., Houmoller L., Rodionova O. Ye. Analytical methods for rapid counterfeit drug detection. International Congress on Analytical Sciences (ICAS-2006), Москва, 2006. Book of abstracts. V. 1. P. 108.

ЩО ТАКЕ БЛИЖНІЙ ІЧ-ДІАПАЗОН?

Близький інфрачервоний діапазон (БІК) електромагнітного спектру тягнеться від 800 нм до 2500 нм (від 12500 до 4000см)-1 ) і знаходиться між середньою ІЧ - областю з більшою довжиною хвиль та видимою областю з більш короткими довжинами хвиль. Середній та ближній діапазони можуть використовуватися для коливальної спектроскопії. У той час як спектри, отримані в середньому ІЧ реєструють головним чином атомні коливання в індивідуальних хімічних зв'язкахбільшості молекул, відповідні спектри БІК показують так звані обертони та комбінаційні смуги.

На шкалі хвильових чисел (див.-1 ) ці обертони з'являються як щось менше, ніж складові частоти основних коливань. Наприклад, основне коливання С-Н зв'язку(n) молекули трихлорметану (CHCl3) відбувається на 3040 см-1 , Перші три обертони (2n, 3n і 4n) - спостерігаються на 5907см-1 , 8666см -1 та 11338см -1 відповідно.

У той же час поглинаюча здатність зменшується зі збільшенням номера обертону, наприклад, серія цих значень для CHCl3 становить 25000, 1620, 48,

1.7 см-1 /міль відповідно.

Завдяки різкому зменшенню інтенсивності вищих обертонів БІК спектри зазвичай пригнічуються обертонами, що перекриваються, і комбінаційними смугами структурно легших груп (наприклад, C-H, N-H і O-H). У межах цих БІК спектрів міститься значна інформація про молекулярну структуру досліджуваного зразка, і цю інформацію можна отримати сучасними методамиобробки даних

Переваги спектроскопії БІК

Швидкість (зазвичай 5 – 10с)

Не потрібно попередньої підготовки зразка

Простота проведення вимірів

Висока точність та відтворюваність аналізу

Немає забруднень

Процес-контроль

Можливість проведення вимірювань через скляну та пластикову упаковку

Автоматизація вимірів

Перенесення методу з одного приладу на інший

Аналіз фізичних та хімічних властивостей

Порівняно з рідинними методами хімічного аналізу, аналіз методом спектроскопії БІК більш швидкий, простий та точний. Вимірювання можуть проводитися дуже швидко, зазвичай час аналізу становить лише 5-10 секунд. Не потрібна попередня підготовка зразка та спеціальне навчання персоналу. Дані спектри можуть містити інформацію про фізичні властивостіматеріалу, таких як розмір частинок, термічна та механічна попередня обробка, в'язкість, щільність і т.п.

ПОРІВНЯННЯ ІЧ-СПЕКТРОСКОПІЇ

ближнього та середнього діапазонів

Скорочення часу підготовки зразка одна із головних переваг ближнього ІЧ проти середнім. Це відбувається, перш за все, через порівняно низький коефіцієнт поглинання для більшості матеріалів в БІК діапазоні. Вимірювання в середньому діапазоні порошкоподібних зразків традиційно виконуються або методом дифузного відображення або пресуванням зразків таблетки та вимірювання спектрів в режимі пропускання. В обох випадках зразки повинні бути спочатку подрібнені тонкий порошок, а потім перемішані з непоглинаючою речовиною, таким як KBr. Подрібнені і перемішані з KBr порошки поміщаються в прес-форму і пресуються таблетки при високому тиску за допомогою гідравлічного або ручного преса. У разі вимірювань в режимі дифузного відображення подрібнений і змішаний з KBr зразок поміщається прямо в склянку для зразка, поверхня зразка вирівнюється і потім вводиться в дифузне приставку для вимірювань. Ці методи підготовки зразків широко і успішно використовуються, але мають недоліки, такі як більш тривалий час для підготовки зразка, більш висока можливість для забруднення зразка, можливе зниження відтворюваності зразок-зразок та користувач-користувач через відмінності, що виникають при приготуванні зразка, і додаткова вартість KBr розріджувача.

Крім того, перевага БІК спектроскопії полягає в тому, що тут для вимірювань твердих та рідких зразків застосовується досить недороге оптоволокно. Порівняні з ним аксесуари для середньої інфрачервоної області або обмежені їх фізичною досяжністю, або крихкістю і складністю роботи з ними. Завдяки всьому цьому БІК спектроскопія набагато привабливіша для використання у виробничому процесі.

ПОРІВНЯННЯ БІК- спектроскопії

та диспергуючих приладів

Фур'є-спектрометри ближнього ІЧ-діапазону істотно відрізняються від дисперсійних спектрометрів ближнього ІЧ-діапазону методом отримання спектру. У приладах, що диспергують, використовується вузька щілина і диспергувальний елемент, наприклад, грати, для перетворення світло в спектр. Цей спектр проектується на датчик чи безліч датчиків, де визначається інтенсивність світла за кожної дині хвилі. Спектральна роздільна здатність диспергуючих приладів визначається фіксованою шириною щілини, зазвичай це становить 6-10нм (від 15см-1 до 25см -1 , При 2000нм). Не можна вибрати дозвіл за допомогою програмного забезпечення, а підвищення роздільної здатності вимагає більш вузької щілини та ослаблення результуючого сигналу. Таким чином, для всіх диспергуючих приладів стоїть проблема вибору між роздільною здатністю та ставленням сигнал/шум.

Спектрометр Фур'є перетворення навпаки використовує інтерферометр, щоб переглянути комбінації довжин хвилі світла, що виникає від широкої лінії джерела ближнього ІЧ-діапазону, і направляє ці комбінації в один детектор.

У кожному скані інтерферометра дані збираються у формі інтерферограми, в якій інтенсивність сигналу зіставлена зі зміщенням частини інтерферометра, що переміщається. Це зміщення інтерферометра безпосередньо пов'язане з довжиною хвилі, і математичне перетворення (перетворення Фур'є) застосовується для побудови графіка інтенсивності сигналу як залежність від довжини хвилі, за якою обчислюється міра поглинання спектра або пропускна здатність спектра.

Одночасно, HeNe лазерний промінь проходить крізь інтерферометр і прямує до власного детектора. Зміщення інтерферометра призводить до максимумів і мінімумів сигналу на цьому лазерному детекторі, які зустрічаються через певні інтервали, кратні довжині хвилі випромінювання лазера. Місця проходження цього сигналу через нуль використовуються як точки збору для перетворення цифрову форму сигналу детектора БІК. Таким чином, завдяки управлінню перетворенням на цифрову форму у Фур'є-спектрометра точність довжини хвилі істотно вище, ніж у будь-якого іншого приладу, що диспергує. Ця точність довжини безпосередньо впливає на умови стабільності моделей калібрування, розроблених на Фур'є-системах, а також на здатність передавати модель калібрування іншим Фур'є-приладам, яка буде описана далі.

Спектральна роздільна здатність для Фур'є- спектрометрів визначається ступенем рухливості інтерферометра, який керується програмним забезпеченням, що дозволяє набагато збільшити роздільну здатність в порівнянні з диспергуючим спектрометром, і, за допомогою програмного забезпечення, вибирати роздільну здатність в ході досліджень. Крім того, широка смуга променя ближнього ІЧ діапазону у Фур'є-приладі спрямована крізь великі кругові апертури замість вузької прямокутної щілини, яку використовують у диспергуючому документі, що забезпечує освітлення більшої області зразка і збільшує інтенсивність світла в детекторі. Ця перевага продуктивності призводить до більшого відношення сигнал/шум для Фур'є-спектрометрів у порівнянні з приладами, що диспергують. Найкраще відношення сигнал/шум призводить до істотного зменшення часу виявлення і, як наслідок, до отримання спектрів більш високої якості на Фур'є-приладі при будь-якій роздільній здатності.

ФУР'Є – СПЕКТРОСКОПІЯ БЛИЖНЬОГО ІЧ-ДІАПАЗОНУ для якісного та кількісного аналізу

Сьогодні багато виробників прагнуть не тільки поставити кінцевий продукт найвищої якості, але також покращити виробничу ефективність за допомогою лабораторного аналізута використання отриманого результату на виробництві. Отримуючи жорсткіший контроль над технологією, можливо оптимізувати використання речовин, додаючи або усуваючи їх, щоб виробити специфіковану продукцію, що зводить до мінімуму витрати на розподіл або переробку.

БІК – спектроскопічна методика, що ідеально підходить для обробки вимірювань через її здатність швидко виконувати дистанційні вимірювання через високоефективне кварцове оптичне волокно. Ослаблення сигналу всередині таких волокон дуже мало (наприклад, 0.1 дБ/км), крім того, БІК оптоволоконні кабелі та міцні датчики, відносно недорогі і широко доступні. Обробні датчики можуть розташовуватись на відстані сотень метрів від спектрометра, а численні датчики можуть бути приєднані до одного спектрометра.

МЕТОДИ ВИМІРЮВАННЯ БІК

БІК методи відбору зразків для твердих речовин засновані або на дифузній відбивній здатності або простому вимірі під час пропускання. Дифузні вимірювання відбивної здатності в основному робляться за допомогою оптиковолоконного датчика або інтегруючої сфери.

На рис. 2 показаний Фур'є - БІК спектрометр MPA (виробництво Bruker Optik GmbH, Німеччина), який має 2 порти оптоволоконних датчиків і окремий відсік для зразка, що дозволяє застосовувати метод прямого пропускання.

На цій фотографії показано поширений датчик коефіцієнта відображення, який використовується для аналізу порошкових зразків у пробірках.

Зразки аналізуються при контакті датчика із зразком матеріалу. Про завершення аналізу сигналізують світлодіоди, що світяться.

Інтегруюча сфера (рис.3) дозволяє збирати дані спектрів від неоднорідних речовин, наприклад, змішаних порошків, зерна, полімерних гранул і т.п. Отримані спектри являють собою просторове усереднення всього матеріалу, що знаходиться у круговому вікні вимірювання (діаметр 25 мм).

Для кращого усереднення може бути використаний стаканчик, що обертається, і автоматичні пробовідбірники.

БІК РЕВОЛЮЦІЯ

У ФАРМАЦЕВТИЧНІЙ

ПРОМИСЛОВОСТІ.

ПРОБЛЕМИ ПЕРЕВІРКИ ЯКОСТІ

Фармацевтична промисловість відома як одна з найважче регульованих галузей промисловості у світі, і фірма Bruker виготовляє для споживачів фармацевтичної продукції прилади для перевірки якості, за допомогою яких споживачі можуть перевірити відповідність препаратів необхідним вимогам. Пакет програмного забезпечення OPUS контролює всі функції спектрометра. У цей пакет програм включена всебічна перевірка набору програм та апаратних засобів. OPUS повністю перевірить правильність функціонування шляхом натискання клавіші. Сюди входить тестування внутрішнього пристрою перевірки, вбудованого спектрометром.

Програмне забезпечення можна запускати в захищеному паролем режимі «GLP», при повному контролі адміністратора над користувачем, його доступом до меню, установкових параметрів і макро програм, що налаштовуються. Блок даних забезпечує повний та автоматичний контроль усіх дій, що здійснюються зі спектрами. Мова програмування, заснована на піктограмах, вбудована у програмне забезпечення, що дозволяє автоматизувати комплексні процедури. Внаслідок цього відбувається збільшення повторюваності та скорочення потенційних похибок.

Bruker є компанією ISO9000, і все програмне забезпечення та апаратні засоби перед доставкою замовнику піддаються строгому контролю якості, кільком стадіям завершального тестування та перевірки. Інсталяція приладу на місці у замовника виконується нашими досвідченими технічними інженерами, які забезпечують замовника справним приладом при доставці та постійно на продовженні всього життя приладу.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ СИРОВИНИ

Одним із перших кроків у виробництві будь-якого фармацевтичного продукту є ідентифікація та перевірка відповідності різної вхідної сировини необхідним вимогам. Спектроскопія БІК через оптоволоконні датчики швидко стає стандартним методом виконання цієї перевірки відповідності, забезпечуючи безпрецедентну швидкість ідентифікації як твердих речовин, так і рідин.

Щоб виконати цей вид аналізу, повинна бути створена така модель калібрування, яка зачіпає речовини, що нас цікавлять. По-перше, необхідно отримати кілька спектрів для кожної сировини, беручи до уваги всі можливі зміни, які можуть виникнути. Сюди зазвичай входять види сировини, одержувані від різних продавців, із різних місць, тощо. Як тільки виміряно спектри, генерується середній спектр кожного матеріалу, і створюється бібліотека всіх таких середніх спектрів, куди вносяться і статистично визначені прийнятні критерії (або пороги) для всіх речовин у бібліотеці.

Потім бібліотека підтверджує, що всі матеріали є унікально ідентифікованими. Тепер бібліотека може використовуватися для ідентифікації нових невідомих речовин, порівнюючи їх спектри зі спектрами бібліотеки, та визначаючи якість потрапляння для кожної речовини, що знаходиться у бібліотеці. Якщо ця якість потрапляння менша, ніж поріг для однієї речовини і більша, ніж поріг для всіх інших речовин, невідома речовина ідентифікована.

Ідентифіковані рідини можуть бути виміряні або виміром при пропусканні у відсіку для зразка (як показано на рис. 1), або за допомогою оптоволоконного імерсійного датчика. У будь-якому випадку, нижчі коефіцієнти поглинання БІК (порівняно із середнім ІЧ) дозволяють використовувати набагато більші довжини шляху зразків (тобто 1 – 10мм). Внаслідок цієї різниці довжини шляху вимірювання у відсіку для зразків стають вигіднішими, оскільки це дозволяє використовувати типові недорогі скляні пробірки замість точних осередків, зменшуючи вартість та тривалість вимірювань.

Кількісний аналіз активних інгредієнтів

Інша важлива частина якісного/кількісного аналізу у фармацевтичній промисловості – кількісний аналіз концентрованих активних інгредієнтів. Цей тип аналізу часто вимагає лабораторного тестування пробних відбитків зразків, які руйнуються протягом випробування. Навпаки, Фур'є - БІК забезпечує економію часу та неруйнівний спосіб виконання кількісного аналізу концентратів у сумішах порошкових або рідких речовин, а також у вже виготовлених фармацевтичних таблетках та капсулах.

ЕФЕКТИВНЕ ЗДІЙСНЕННЯ ВИБІРКИ

Ключовим фактором успіху Фур'є – БІК для кількісного аналізу є вибір методу вибірки зразків, часто це з'єднання автоматизованої та ручної вибірки. Підприємства Bruker виготовляють аксесуари для здійснення вибірки спеціально для завдань фармацевтичної промисловості. Наприклад, автоматичний пробовідбірник (рис. 5) може бути встановлений у відсіку для зразків будь-якого Фур'є - БІК спектрометра Bruker.

Особливістю цього аксесуара є диск, що настроюється для зразків, який може вміщати в себе до 30 зразків. Користувач обробляє пази для таблеток, а пересування диска програмним забезпеченням OPUS або довільною макрокомандою та/або зв'язком з централізованою системою розподіленого управління в межах заводу - виробника.

ПРИКЛАДИ АНАЛІЗУ АКТИВНОГО ІНГРЕДІЄНТА

Прикладом кількісного аналізу концентрату активного інгредієнта у закінченій фармацевтиці Фур'є – БІК є визначення концентрації ацетилсаліцилової кислоти (АСК) у таблетках аспірину. Щоб провести цей аналіз, для обробки спектрів, отриманих з аспіринових таблеток з відомою концентрацією АСК, використовували метод найменших квадратів (МНК). Концентрація АСК у зразках становила від 85 до 90%. Крім АСК таблетки містили два типи крохмалю в діапазоні 0-10%.

Щоб встановлювати модель МНК для цієї багатокомпонентної системи, всього при роздільній здатності 8см-1 було зареєстровано 44 спектри. Оптимальний діапазон для АСК був визначений за допомогою пакета програм OPUS-Quant/2 (взаємною перевіркою правильності). Середньоквадратична похибка склала 0.35%, а розбіжність R 2 – 93.8%. Ця похибка перебувала у межах, заданих замовником. Графік істинних та обчислених концентрацій показаний на малюнку 6.

ВИБІРКА ЧЕРЕЗ УПАКОВКУ

Крім того, демонструвалося визначення концентрації активного інгредієнта таблеток аспірину через пластмасові матеріали прозорої упаковки за допомогою оптоволоконного датчика дифузного відображення, як показано на малюнку 7. У спектрах, що виходять, з'явилися опуклі діапазони від полімерного матеріалу прозорої упаковки, але дві окремих області (6070-59-1 та 4730-4580см -1 ), містять піки від аспірину, все ще видимі і використовувалися для створення калібрувальної моделі.

Графік істинних і знайдених концентрацій показаний малюнку 8). Середньоквадратична похибка склала 0.46%, а розбіжність R 2 - 91.30 %, ці значення знову перебувають у межах, заданих замовником. Спектри, отримані у цьому прикладі, показано на малюнку 9.

ПЕРЕВАГИ ЗБІЛЬШЕННЯ ДОЗВОЛЬНОГО ЗДАТНОСТІ

У СПЕКТРАЛЬНОМУ АНАЛІЗІ

До недавнього часу більшість виданих результатів у БІК спектроскопії було отримано за допомогою диспергуючих приладів низькою роздільною здатністю, у них спектральна роздільна здатність розташовується між 6 і 10 нм (від 15см-1 До 25 см -1 , При 2000 нм). Поява Фур'є-БІК спектрометрів призвела до значних успіхів в умовах високороздільних можливостей (краще, ніж 2 см)-1 ) спектроскопії БІК.

БІК спектри зазвичай характеризуються високою спектральною поглинаючою здатністю, що не вимагає високої роздільної здатності. Тоді часто зустрічаються ситуації, коли бажана модель калібрування від спектрів низького дозволу може бути створена. Крім того, високороздільна здатність безпосередньо впливає на точність довжини хвилі приладу і, отже, на стабільність результатів та «транспортабельність» моделей калібрування.

На досвіді, щоб продемонструвати значення збільшення роздільної здатності в спектральному аналізі, були виміряні спектри БІК 5 таблеток з різними невисокими концентраціями активного інгредієнта. Спектри були виміряні при роздільній здатності 8 см-1 та 2 см -1 , після чого за допомогою OPUS було створено ідентифікаційну модель для таблеток. При роздільній здатності 2 см-1 , модель могла розрізнити лише плацебо та таблетки з активними інгредієнтами, у той час як при вищій роздільній здатності 8 см-1 , всі концентрації ясно помітні.

Малюнок 10a показує спектри та графік, отриманий для двох перших основних компонентів вимірювань при 8 см-1 . На малюнку 10б показані спектри та графік, отриманий для перших двох основних компонентів вимірювань при 2 см-1 . 5 областей в останньому графіку вказують, що модель з більш високою роздільною здатністю дозволяє чітко відрізнити 5 рівнів концентрації активного інгредієнта.

ВИЗНАЧЕННЯ ТОВЩИНИ ПОКРИВАЮЧОГО ШАРУ

Фур'є - БІК спектроскопія також успішно використовується визначення товщини шару на фармацевтичних таблетках. При проведенні цього дослідження було проведено кілька випробувань, включаючи досліди з нелінійними відносинами між мірою поглинання світла і товщиною шару, подібністю до складу ядра та покриття матеріалу, і відсутність достатньої кількості зразків калібрування для стандартного калібрування МНК. Пік при 7184 см-1 , який диференціює матеріал серцевини від матеріалу покриття, був ідентифікований, коли були зібрані спектри БІК з високою роздільною здатністю (2 см-1, 0.4 нм при 7184 см-1 ) на Фур'є – БІК спектрометрі IFS-28/N фірми Bruker (див. рисунок 11).

Дослідження показують, що товщина шару може бути змодельована як поліноміальна апроксимація пікової області цього вибіркового піку (див. рис. 12), в той час як калібрування методом найменших квадратів тих же даних неможлива через відсутність достатньої кількості калібрувальних зразків. Також це калібрування успішно застосовується для цілого ряду таблеток, але неприйнятне для оптоволоконних вимірювань дифузного відображення, через недостатнє проникнення оптоволокна в ядро.

ПЕРІНОС КАЛІБРУВАННЯ

Розробка стабільної та надійної в експлуатації моделі калібрування - дуже трудомістка робота, що вимагає значної кількості ресурсів, яка включає підготовку та аналіз великої кількості зразків стандартним методом, а потім їх аналіз методом Фур'є - БІК. Таким чином, важливо, щоб була розроблена калібрувальна модель, яку можна використовувати через якийсь час, і для якої не має значення, який використовується вид приладу, тип джерел, детекторів, датчиків і т.д.

Крім того, деякі фактори впливають на перенесення калібрування з одного приладу на інший. Сюди входять, наприклад, довжина хвилі та фотометрична точність різних приладів. Тому для всіх моделей калібрування, що переносяться з одного приладу на інший, необхідно знову проводити вимірювання хоча б оригінального набору калібрувань (або повний набіркалібрування) на новому приладі, щоб визначити коригувальні коефіцієнти, які дозволять моделі працювати на новому приладі.

Іноді це призводить до труднощів при перенесенні калібрувальної моделі, а іноді, у разі рідкісних або змінних зразків калібрування, таке перенесення взагалі неможливе.

Зазвичай труднощі при перенесенні моделі калібрування доставляє точність довжини хвилі на цих двох приладах. Відсутність стійкої осі довжини хвилі – фактор, який сильно обмежує можливість перенесення калібрувальної моделі серед диспергуючих приладів. Тому Брукерівська виробнича лінія Фур'є - БІК спектрометрів з високою роздільною здатністю приладу має велику перевагу, використовуючи вісь довжини хвилі як спосіб калібрування.

Для цього розглядається вузька область у спектрі атмосферної водяної пари з відомою постійною довжиною хвилі, яка використовується як еталон довжини хвилі. Це дозволяє спектрометрам Фур'є - БІК (виробництва Bruker Optik GmbH, Німеччина) забезпечувати набагато більш високу точність довжини хвилі, ніж будь-який прилад, що диспергує. В результаті можлива пряма передача калібрування від одного Фур'є - БІК приладу до іншого. Не можна недооцінити перевагу цієї особливості, що дозволяє уникнути дорогого перекалібрування в умовах економії часу, грошей та зусиль.

Один такий приклад перенесення калібрувальної моделі для визначення кількості вмісту спирту в спиртних напоях показаний в таблиці 1. Калібрування здійснювалося на Брукерівському спектрометрі IFS-28/N з імерсійним датчиком A, і було згодом переміщено на Брукерівський спектрометр Vector 22/N з імерсійним датчиком. Після передачі порівняння R 2 та похибок середньоквадратичного відхилення показали успішність проведення прямої передачі калібрування. Додаткові випробування показали успішність проведення прямої пересилки інших калібрувальних моделей з приладу на прилад, а також прямої пересилки моделей на одному приладі, після заміни всіх головних компонентів системи, включаючи БІК джерело, HeNe лазер, детектор, датчики та електроніку.

ТЕСТ НА ВІДПОВІДНІСТЬ

Часто необхідно визначити відповідність кінцевого продукту певному стандарту. Це легко зробити на спектрометрах Bruker, які використовують Тест на відповідність . Для декількох вибраних зразків кожної речовини вимірюється ряд спектрів, який буде перевірений на відповідність спектрам, визначеним стандартним незалежно методом. Для кожної речовини поряд із спектром середньоквадратичного відхилення генерується середній спектр. Потім проводиться аналіз нових зразків даної речовини, порівняння їх спектрів із збереженим середнім спектром та оцінка, чи знаходиться новий спектр у допустимих межах, визначених спектром середньоквадратичного відхилення та коефіцієнтом, регульованим замовником. Типовий звіт тесту на відповідність показаний малюнку 13.

АНАЛІЗ СУМІШІ

Багато фармацевтичних процесах часто необхідний аналіз процесу змішування двох або більше компонентів. Аналіз суміші відіграє важливу роль при змішуванні порошків, де зразкам властива неоднорідність. Оптимальне співвідношення в суміші дає визначення кінцевого продукту. Процес змішування повинен перевірятись у реальному часі за допомогою Фур'є – БІК спектроскопії. З правильних еталонних сумішей знімають спектри, а потім обчислюють середній спектр спектр середньоквадратичного відхилення. Після цього знімають спектри під час перемішування, обробляють їх та порівнюють із середнім спектром. Процес змішування зупиняють, якщо отриманий спектр потрапляє за поріг середнього спектру бажаної суміші, що визначається користувачем.

ВИСНОВОК

Спектроскопія Фур'є - БІК є швидким, легким у використанні та достовірним інструментом для гарантії якості та контролю якості у фармацевтичній промисловості. Розширені експлуатаційні показники технології перетворення Фур'є дають можливість проводити більш важкі дослідження та дозволяють передавати калібрування безпосередньо. Крім того, серед споживачів у фармацевтичній промисловості поширені такі методи, як ідентифікація сировини та перевірка якості, визначення концентрації активного інгредієнта, тест на відповідність кінцевих продуктів та аналіз суміші у продуктах.

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ

ЗАГАЛЬНА ФАРМАКОПЕЙНА СТАТТЯ

Cпектрометрія у ближній ОФС.1.2.1.1.0001.15

інфрачервоної області Вводиться вперше

Спектрометрія в ближній інфрачервоній (БІК) області – метод, що ґрунтується на здатності речовин поглинати електромагнітне випромінювання в діапазоні довжин хвиль від 780 до 2500 нм (від 12500 до 4000 см-1).

Поглинання в БІК діапазоні пов'язане, як правило, з обертонами основних коливальних частот зв'язків CH, NH, OH і SH та їх комбінаціями. Найбільш інформативним діапазоном є область від 1700 до 2500 нм (від 6000 до 4000 см-1).

Для спектрометрії в БІК області характерні простота підготовки проб або відсутність пробопідготовки, швидкість вимірювань, неруйнівний характер аналізу (без розкриття упаковки лікарського препарату), одночасна оцінка кількох параметрів (показників), проведення дистанційного контролю, у тому числі у технологічних потоках у режимі реального часу.

БІК-спектрометрія дозволяє прямо чи опосередковано проводити якісну та кількісну оцінку хімічних, фізичних та фізико-хімічних характеристик аналізованого об'єкта, у тому числі:

– гідроксильне та йодне число, ступінь гідроксилювання;

– кристалічну форму та ступінь кристалічності;

- Поліморфну форму або псевдополіморфну форму;

- Дисперсність частинок та інші.

Аналіз інформації, що витягується з БІК-спектрів, проводиться із застосуванням хемометричних алгоритмів.

Устаткування

БІК-спектрометри складаються з:

джерела випромінювання, наприклад, кварцової лампи (лампи розжарювання) або аналога;
монохроматора (дифракційні грати, призма, оптико-акустичний фільтр) або інтерферометри (для Фур'є-спектрометрів);
реєструючого пристрою – детектора (на основі кремнію, сульфіду свинцю, арсеніду індія, арсеніду індія-галію, телуриду ртуті-кадмію, дейтерованого тригліцину сульфату та ін);
пристрої розміщення зразка та/або дистанційного оптоволоконного зонда.

Спектрометри можуть бути оснащені кюветним відділенням, що інтегрує сферою (інтегруюча сфера являє собою оптичний компонент, що складається з сферичної порожнини з покриттям з добре відбиває матеріалу, сфера призначена для отримання спектрів відображення неоднорідних зразків), зовнішніми модулями для вимірювання пропускання зразків, що сильно розсіюють, зразків, оптоволоконними зондами тощо. Вибір того чи іншого пристрою для аналізу залежить від типу зразка і обраного способу вимірювання.

Для розміщення зразків використовують скляні або кварцові кювети, флакони, скляні склянки, тримачі капсул або таблеток та інші пристрої.

Обробка даних та аналіз отриманих результатів проводиться з використанням спеціального програмного забезпечення.

Для кожного режиму вимірювання (пропускання, дифузне відображення та їх комбінація) має бути передбачена своя методика перевірки, що включає перевірку точності та відтворюваності хвильової шкали, лінійності, стабільності відгуків та фотометричного шуму.

Перевірка точності хвильової шкали.Для перевірки точності хвильової шкали реєструють спектр стандарту, що має характеристичні максимуми та мінімуми поглинання, та порівнюють отримані значення довжин хвиль із заявленими характеристиками. Як стандарти використовують оксиди рідкісноземельних елементів, пари води в атмосфері, метиленхлорид та інші.

У приладах з Фур'є-перетворенням шкала хвильових чисел лінійна у всьому робочому діапазоні, і для перевірки точності хвильової шкали достатньо використовувати один стандарт із контролем заявлених характеристик по одній смузі поглинання. Прилади інших типів можуть мати нелінійний характер шкали хвильових чисел і вимагають перевірки заявлених метрологічних характеристик не менше ніж за трьома піками (один або кілька стандартів) з охопленням всього робочого діапазону.

Похибка при встановленні довжин хвиль повинна бути не більше ± 1 нм (або еквівалентна йому величина хвильового числа) у діапазоні довжин хвиль до 1900 нм та не більше ± 1,5 нм для діапазону довжин хвиль ≥ 1900 нм.

Відтворюваність установки довжини хвиліповинна відповідати вимогам заводу-виробника або вимогам нормативних документів, що діють на території Російської Федерації.

Перевірка фотометричної лінійності та стабільності відгуків.Для перевірки фотометричної лінійності реєструють БІК-спектри стандартів з відомими значеннями пропускання або відображення та будують графічну залежність отриманих значень пропускання або відображення відомих значень. Результатом побудови такої залежності має бути пряма лінія з відсіканням (0,00 ± 0,05) та тангенсом кута нахилу прямої (1,00 ± 0,05).

Для перевірки фотометричної лінійності в режимі відображення як стандарти використовуються полімери, доповані вуглецем, або аналоги. Якщо прилад використовується для вимірювання зразків з поглинанням 1,0 і менше, достатньо використовувати 4 стандарти в діапазоні значень відображення від 10 до 90%, наприклад, 10, 20, 40 і 80% з відповідними значеннями поглинання 1,0; 0,7; 0,4 та 0,1. При вимірі зразка з поглинанням вище 1,0 до вказаного набору стандартів додають стандарт відбиття 2 та/або 5 %.

Для перевірки фотометричної лінійності в режимі пропускання як стандарти використовують 3 фільтри зі значеннями пропускання в області від 10 до 90 % і лінію 100 % пропускання, тобто. реєструють спектр пропускання порожнього каналу.

Для перевірки стабільності відгуку періодично проводять вимір стандарту з незміненими фізичними та хімічними властивостями. Вимірювання фону повинно проводитись за допомогою одного і того ж внутрішнього або зовнішнього стандарту. Відхилення фотометричного відгуку не повинно перевищувати ±2%.

Перевірка фотометричного шуму.Для оцінки фотометричного шуму при вимірі пропускання записують лінію 100% повітрям; при вимірі відображення реєструють лінію 100% із застосуванням відповідних стандартів із відображенням не менше 99%. При цьому під лінією 100% мається на увазі вимір, при якому стандарт є вимірюваним зразком і тлом одночасно. При високих значеннях поглинання проводять оцінку фотометричного шуму із застосуванням стандартів зі значеннями пропускання або відображення близько 10%.

Фотометричний шум повинен відповідати вимогам, вказаним у специфікації виробника.

Способи виміру

БІК-спектр є залежністю відповідної фотометричної величини [оптичної щільності ( А), коефіцієнта пропускання ( Т), коефіцієнта відображення ( R) та похідних величин] від довжини хвилі або частоти випромінювання. При вимірах в БІК області реалізуються такі способи:

- Вимірювання пропускання (або поглинання) при проходженні випромінювання через зразок;

- Вимірювання випромінювання, відбитого або розсіяного від зразка;

- Комбінація вищезазначених способів.

Вимірювання завжди проводять щодо тла.

Вимірювання пропускання.Пропускання є мірою зниження інтенсивності випромінювання під час проходження через зразок. Цей принцип реалізований у більшості спектрометрів, що використовуються, і результат може бути представлений безпосередньо в одиницях пропускання ( T) та/або оптичної щільності ( A).

I 0 - Інтенсивність падаючого світла;

I- Інтенсивність світла, що пройшло через зразок;

Спосіб застосовується для твердих і рідких проб, у тому числі для дисперсних систем.

Спеціальної підготовки проб при вимірі пропускання зазвичай не потрібно. Для вимірювання спектра рідких зразків використовують флакони або кювети з відповідною довжиною оптичного шляху (зазвичай 0,5 – 22 мм), а також оптоволоконні зонди зі спеціальною насадкою.

Дифузне відбиття.У методі дифузного відбиття вимірюють коефіцієнт відбиття ( R), що представляє відношення інтенсивності світла, відбитого від зразка ( I), до інтенсивності світла, відбитого від фону ( I r):

або зворотну логарифмічну величину цього відношення ( А R):

Як фон використовують поверхню з високою величиною R: пластини із золота, насичених перфторованих полімерів, керамічні пластини та інші відповідні матеріали.

Спосіб використовується для аналізу твердих зразків із застосуванням інтегруючої сфери або оптоволоконних зондів, що працюють у режимі відображення. В останньому випадку для відтворення одержуваних результатів необхідно забезпечити стабільність умов проведення вимірювань, зокрема відносну нерухомість зонда, ступінь зіткнення з датчиком зразком та інші умови.

Пропускання - відображення. Даний спосіб є комбінацією пропускання і відображення завдяки спеціальній конструкції кювет і датчиків, в яких випромінювання двічі проходить через зразок, що дозволяє аналізувати зразки з низькою здатністю, що поглинає і розсіює.

Як фотометричну величину використовують коефіцієнт подвійного пропускання ( Т*):

I T- Інтенсивність випромінювання після подвійного пропускання, без зразка;

I– інтенсивність пропущеного та відбитого випромінювання, виміряна із зразком;

і величину, аналогічну оптичній щільності ( А*):

Як фон використовують спектр повітря або середовища порівняння.

Спосіб застосовується для рідких, у тому числі негомогенных проб.

Для реєстрації спектра досліджуваний зразок поміщають у кювету з дзеркалом або іншим відбивачем дифузним. Можливе використання оптоволоконного зонда із спеціальною насадкою, який занурюють у зразок.

Чинники, що впливають на результати вимірювань

Температура зразка.Температура зразка може впливати як на його пропускання, так і на його відображення. Контроль температури важливий при аналізі термічно лабільних об'єктів, у разі яких різниця в кілька градусів може призводити до суттєвих спектральних змін, у тому числі твердих зразків, що містять воду, дисперсних систем, аморфних об'єктів та інше.

Волога та залишкові кількості розчинників.Наявність води та залишкових кількостей розчинників може вплинути на характер спектру та результати аналізу. Необхідність та умови висушування мають бути зазначені у фармакопейних статтях.

Товщина зразкавизначає ступінь пропускання. Зі збільшенням товщини шару спостерігається збільшення поглинання. Тому при порівняльних вимірах пропускання товщина зразка має бути однаковою або враховуватися. При вимірі відображення товщина шару немає принципового значення, але слід враховувати, що товщина шару має бути порівнянною з глибиною проникнення променя в зразок. У разі недостатньої товщини за зразком ставиться додатковий матеріал, що рефлектує, наприклад штамп із золотим покриттям.

Оптичні властивості зразка.При аналізі твердих зразків необхідно забезпечувати максимально можливу однорідність проби, оскільки відмінності в густині або розмірах часток позначаються характері спектра. Спектри фізично, хімічно чи оптично гетерогенних зразків слід реєструвати або зі збільшеним розміром пучка світла, або використовуючи пристрої, що обертають зразки під час вимірювань. При цьому бажано проводити вимірювання кожного зразка кілька разів із подальшим усередненням спектрів.

Поліморфізм.Різниця в кристалічній структурі (поліморфізм) впливає на спектр, що дозволяє відрізняти один від одного кристалічні або аморфні форми на підставі їх БІК-спектрів. Під час проведення аналізу необхідно враховувати кристалічну структуру (модифікацію) еталонного спектра, що у методі аналізу.

Вік зразків.Властивості зразків можуть змінюватися в часі, і ці зміни можуть зумовлювати спектральні відмінності для тих самих зразків. Дані зміни повинні бути враховані при побудові калібрувальних моделей як для цілей ідентифікації, так і для цілей кількісного аналізу.

ЯКІСНИЙ АНАЛІЗ

Якісний аналіз (кваліфікація та ідентифікація) у БІК-спектрометрії заснований на схожості спектрів однієї і тієї ж речовини.

Для проведення якісного аналізу спочатку створюють бібліотеку стандартних спектрів, підбирають оптимальну математичну модель для обробки спектрів та реалізації алгоритмів їхнього порівняння. Далі проводять валідацію бібліотеки разом із обраною математичною моделлю (див. розділ «Валідація якісних методів»). Якісний аналіз проводять шляхом порівняння спектра випробуваного зразка зі спектрами бібліотеки (див. розділ «Аналіз даних»).

Створення бібліотеки спектрів

Бібліотека представляє сукупності спектрів, що містять характеристичну інформацію про кожен об'єкт аналізу. Для кожної сукупності спектрів за допомогою відповідних методів та алгоритмів визначають оптимальні параметри ідентифікації. Ці установки дійсні для всієї бібліотеки. Для близьких об'єктів, невиразних при заданих установках, створюються підбібліотеки, у яких можуть бути використані інші методи попередньої обробки спектрів та алгоритми аналізу. Кількість спектрів у бібліотеці не обмежується.

У бібліотеку включають спектри речовин, що відповідають вимогам, які якість підтверджена фармакопейними або іншими атестованими методами.

Для врахування можливих варіацій властивостей кожного виду об'єктів, що аналізуються, реєструють спектри декількох серій (партій). Реєстрацію спектрів проводять у схожих умовах вимірювань і виконують однакову попередню обробку. Вибрана попередня обробка включених до бібліотеки спектрів зберігається незмінною при наступних вимірах.

Методи попередньої обробки спектрів

Рекомендується проводити попередню обробку спектрів з метою підвищення інформативності одержуваних результатів та зменшення впливу спектральних варіацій. Обробка первинних даних може містити обчислення першої або другої похідної, нормалізацію, мультиплікативну корекцію розсіювання та інші методи або їх комбінації. При виборі методів попередньої обробки спектрів слід враховувати, що можуть призвести до втрати інформації чи появі помилок-артефактів.

Аналіз даних

Порівняння спектрів випробуваних зразків за якісного аналізу проводиться з індивідуальними чи усередненими спектрами у бібліотеці, зокрема з допомогою різних математичних методів.

Бібліотека може бути використана для побудови алгоритмів класифікації. Можливе використання різних алгоритмів, наприклад, методу головних компонентів (МГК), комбінованого з кластерним аналізом, методу SIMCA (soft independent modeling of class analogy – незалежного моделювання аналогій класів), а також інших алгоритмів, як включених у математичне забезпечення БІК-спектрометрів, так та розроблених третьою стороною. Надійність методу, що використовується, повинна бути перевірена. Наприклад, коефіцієнт кореляції, сума квадратів відхилень, відстані всередині моделі та інші показники мають бути узгоджені з рівнем прийняття рішень, представленим у процедурі валідації.

Метод аналізу має бути валідований.

Валідація методу якісного аналізу

Валідація методу має продемонструвати його придатність для цілей аналізу.

Валідація методу проводиться на перевірочному наборі об'єктів, які брали участь у побудові методу, і передбачає перевірку специфічності, чутливості та стійкості (робастності).

Чутливість показує, яка частина об'єктів перевірочного набору, схожих на об'єкти бібліотеки, правильно розпізнається як «свої».

Специфіка показує, яка частина об'єктів перевірочного набору, відмінних від бібліотечних, правильно розпізнається як «чужі».

Особлива увага приділяється результатам класифікації об'єктів, спектри яких візуально схожі на спектри об'єктів бібліотеки, але відрізняються від них за композицією або хімічною структурою. Такі зразки мають правильно визначатися як «чужі».

Стійкість показує, що незначні зміни умов (наприклад, температура, вологість повітря, вібрації, температура зразка, ступінь ущільнення матеріалу, глибина занурення зонда, товщина шару тощо) не впливають на результати та надійність ідентифікації чи кваліфікації.

Кількісний аналіз

Розробка калібрувальної моделі

При розробці моделі встановлюється залежність зміни інтенсивності поглинання або відображення спектру зразків від зміни властивостей та/або складу речовин. При цьому реєструють спектри зразків з відомими значеннями їхнього складу та/або їх властивостей, підтверджених атестованими методами. Так як хемометричні алгоритми не допускають екстраполяцій, необхідно, щоб область калібрувальних концентрацій була не менш очікуваного діапазону аналізованих концентрацій або інших кількісних характеристик. Калібрувальні зразки мають бути по можливості рівномірно розподілені всередині діапазону робочих концентрацій.

Реєстрацію спектрів проводять при дотриманні параметрів експерименту, факторів, що впливають на результати вимірювань та первинної обробки, які попередньо оптимізовані для всіх об'єктів, що аналізуються, і зберігаються постійними при наступних вимірюваннях.

Калібрувальну модель оптимізують за допомогою відповідного способу попередньої обробки спектрів, вибору спектральної області та математичного алгоритму.

Попередня обробка спектрів

Проводять так, як описано в розділі «Якісний аналіз».

Аналіз даних.Для побудови калібрувальної моделі можна використовувати будь-який обгрунтований математичний алгоритм. Так як в області БІК діапазону спостерігається сильне перекриття смуг поглинання, кількісний аналіз проводять переважно хемометричними алгоритмами, наприклад такими, як метод проекцій на латентні структури (ПЛС, англ. PLS), метод регресії на головні компоненти (РГК, англ. PCR) та іншими .

Валідація калібрувальної моделі

Валідація моделі калібрування передбачає демонстрацію її придатності для вирішення поставленої мети. При цьому мають бути визначені такі валідаційні характеристики: специфічність (селективність), лінійність, робочий діапазон концентрацій (аналітична область), правильність, прецизійність та стійкість (робастність).

При побудові калібрувальних моделей за допомогою хемометричних методів аналізу якість калібрування оцінюється за середньоквадратичним залишком калібрування ( RMSEC) та середньоквадратичному залишку прогнозу ( RMSEP).

Для порівняння результатів калібрування, побудованого за БІК-спектрами, з результатами, отриманими за атестованою методикою, можуть бути використані альтернативні статистичні методи (парний t-Тест, оцінка зміщення та ін).

Викиди

При аналізі БІК методом слід враховувати, коригувати і обґрунтовано виключати результати, що різко виділяються.

Усі викиди підлягають аналізу та, у разі їх інформативної важливості або підтвердження правильності за допомогою атестованої методики, вони можуть бути включені до моделі.

Ревалідація або повторна валідація

Метод якісного чи кількісного аналізу, що пройшов валідацію і визнаний придатним для застосування, потребує періодичної повторної валідації або ревалідації. У разі виявлення відхилень необхідно провести коригування методу.

БІК метод повторно валідують, якщо:

до бібліотеки додано новий об'єкт (для якісного аналізу);
є передумови до зміни характеристик об'єктів, спектри яких вже включені до бібліотеки (зміна технології виробництва (синтезу), складу, якості вихідної сировини упаковки тощо);
виявлено інші зміни та/або невідповідності у властивостях аналізованих об'єктів або методики.

Перенесення моделей

При перенесенні моделей якісного та кількісного аналізу з одного приладу на інший повинні враховуватися спектральні характеристики спектрометрів, що використовуються (дозвіл, діапазон хвильових чисел та ін.). Під процедурами перенесення моделей розуміються різні хемометричні алгоритми (математичні та статистичні). Після перенесення в інший прилад на підтвердження працездатності моделі її необхідно ревалідувати.

Збереження даних

Зберігання даних здійснюється в електронному вигляді відповідно до вимог програмного забезпечення. При цьому необхідно зберігати вихідні спектри, які не зазнали математичної обробки, з метою їхнього можливого подальшого використання під час оптимізації бібліотек чи методів.